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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)

[求助] 实验要做基因克隆，本人零基础，真诚求助!

本人要克隆鲤鱼丙酮酸激酶（PK）的基因，关于分子生物学的知识只知道些皮毛，目前刚学会在NCBI上查找基因序列：查到了罗非鱼PK的基因组（NT）；罗非鱼PK的转录序列1(XM),和转录序列2(XM),这俩个都是mRNA；还有大西洋鲑PK的成熟mRNA序列（NM）。请问接下来该怎么办？是比查找保守序列进行引物设计吗？要不要做RACE？需要提取的是DNA还是总RNA？还是两者都提取？......问题太多了，有些茫然啊，恳请大神给小弟指点迷津，或者是介绍一点有关分子生物学的书籍，小弟感激不尽。
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1楼 2013-07-18 22:22:53
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-19 00:41:57
如果你的序列已经在NCBI上报道过，那就直接根据已报道的序列设计引物P就好了
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2楼2013-07-18 22:34:08
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-07-18 22:34:08
如果你的序列已经在NCBI上报道过，那就直接根据已报道的序列设计引物P就好了

米有报道啊
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3楼2013-07-18 22:45:33
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

没有报道的话，可以分析同源性，如果有保守区域，在保守区域设计简并引物扩增，但是不一定能扩出来
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4楼2013-07-19 08:12:38
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冰糖-葫芦娃: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-20 21:54:08
比对相似生物的同一个基于的保守区，然后设计简并引物P，然后测序，是你要的结果，再做RACE，然后得到基因的全长序列，找出基因的ORF，然后设计全长引物P，再测序，确定克隆基因正确。你搜的其他物种是RNA序列你就提RNA，反之，提DNA。别茫然，不会什么，去学就是了。分子克隆第三版可以看，上面所有分子方面的试验几乎全部都有，方法可以直接使用。
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5楼2013-07-19 08:44:49
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冰糖-葫芦娃

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-07-19 08:44:49
比对相似生物的同一个基于的保守区，然后设计简并引物P，然后测序，是你要的结果，再做RACE，然后得到基因的全长序列，找出基因的ORF，然后设计全长引物P，再测序，确定克隆基因正确。你搜的其他物种是RNA序列你就提 ...

那找相似生物是找哪些呢？是在其他脊椎动物中找？还是只在鱼类中找？怎么比对保守区？比对的是DNA还是RNA？还有什么叫兼并引物？抱歉问题太多了......分子克隆第三版在哪可以下载？多谢
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6楼2013-07-19 11:52:38
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