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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何使大肠杆菌表达的时候不产生包涵体
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南林大蕙

金虫 (初入文坛)

[求助] 如何使大肠杆菌表达的时候不产生包涵体

我在用大肠杆菌表达乙酰酯酶，但是表达出来后收集菌液超声波不能超开，分析可能是形成了包涵体，求助大神帮忙，如何才能表达出目的蛋白而不产生包涵体
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1楼 2013-07-16 19:11:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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南林大蕙(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-18 22:01:54
再高水平表达蛋白时候，新生肽链的聚集速度一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。
所以，要不产生包涵体，在表达时候能做的就是降低诱导温度（建议16℃）和IPTG浓度（建议0.1mM终浓度），条件允许的话可以进一步确定条件。
但是有些蛋白本身就是容易产生包涵体。不嫌麻烦，可是换表达载体或者换表达菌株，如果酶切的蛋白，可以试着加trx tag可以增加蛋白可溶性。
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7楼2013-07-17 12:58:28
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
南林大蕙(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-18 22:02:08
1、即使是包涵体形式表达，也不会超声超不开的！！要真正确定是包涵体，是需要破碎，离心，上清和沉淀跑电泳的。
2、包涵体表达不一定就不好。
3、不想包涵体表达，途径是很多的。换载体、降低温度和诱导剂浓度（降低合成速率）都不一定是有效的。加标签（GST、SUMO等）一般是有用的，但是纯化后要水解掉。还有可以改成真核表达，如果有技术基础，这个我比较推荐。
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活到老学到老
8楼2013-07-17 14:08:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-17 00:52:46
防止包涵体出现常用的方法：1.降低重组菌的生长温度是防止包涵体出现最常用的方法。低生长温度降低了无活性的聚集体的形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平降低，也可以减少包涵体的形成。2.在培养重组菌时提供丰富的培养，创造最好的培养条件，如：供氧充足、合适的pH值等，以减少包涵体的形成。3.添加可促进重组蛋白质可溶性表达生长添加剂，增加细胞的渗透压。4.在低浓度的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白质的表达量，也可减少包涵体的形成。5.利用硫氧还原蛋白融合表达或与目标蛋白质共表达，得到可溶性的蛋白质。6.筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白质可溶。7.与目标蛋白质共表达某些能够在目标蛋白质折叠过程中起作用的分子伴侣，得到得到可溶性的蛋白质。
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3楼2013-07-17 00:38:19
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hhxq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
南林大蕙: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能解释的更详细一点啊，我们用的载体是pET-20b，菌是BL21。 2013-07-17 09:32:56
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:43:39
个人觉得换载体表达比较有效。想pGEX以及SUMO等载体就能增加蛋白的可溶性。还有可以试试别的表达菌株，如transB就有利于含二硫键蛋白的折叠。
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4楼2013-07-17 09:14:16
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龙鱼1979

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以加一个可溶性标签，比如GST标签
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6楼2013-07-17 10:54:42
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风之游魂

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 22:02:34
最根本的解决方式还是添加信号肽
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9楼2013-07-17 16:39:26
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木笑子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
南林大蕙(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 22:02:29
改用弱启动子表达，比如PBAD启动子，降低表达速率。
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10楼2013-07-17 17:17:07
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hhxq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by hhxq at 2013-07-18 08:53:07
你可以试试pGEX-6P-1或者4T-1，不过你得有GEX的纯化柱子，还有相应的酶才能把蛋白切下来。...

是GST的纯化柱子。
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12楼2013-07-18 08:54:28
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acvhreinlg

银虫 (正式写手)
可以换表达载体，降低诱导温度，超声破碎是比较剧烈的，要在这部当心，不放心可以测个粗酶活
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科研是将金钱转换为知识的过程，而创新则是将知识转换为金钱的过程。
18楼2013-10-28 14:21:45
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 00:52:17
你可以试试降低诱导温度和IPTG浓度。如果表达量小一些，速度慢一些可能会减少包涵体的形成。不过这也和具体的蛋白有关，有些蛋白表达出来几乎全在包涵体里面，没有办法的。
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2楼2013-07-17 00:07:58
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hyphen007
5楼2013-07-17 10:10:33
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