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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何使大肠杆菌表达的时候不产生包涵体
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南林大蕙

金虫 (初入文坛)

[求助] 如何使大肠杆菌表达的时候不产生包涵体

我在用大肠杆菌表达乙酰酯酶，但是表达出来后收集菌液超声波不能超开，分析可能是形成了包涵体，求助大神帮忙，如何才能表达出目的蛋白而不产生包涵体
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1楼 2013-07-16 19:11:16
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
南林大蕙(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-18 22:01:54
再高水平表达蛋白时候，新生肽链的聚集速度一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。
所以，要不产生包涵体，在表达时候能做的就是降低诱导温度（建议16℃）和IPTG浓度（建议0.1mM终浓度），条件允许的话可以进一步确定条件。
但是有些蛋白本身就是容易产生包涵体。不嫌麻烦，可是换表达载体或者换表达菌株，如果酶切的蛋白，可以试着加trx tag可以增加蛋白可溶性。
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7楼2013-07-17 12:58:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 00:52:17
你可以试试降低诱导温度和IPTG浓度。如果表达量小一些，速度慢一些可能会减少包涵体的形成。不过这也和具体的蛋白有关，有些蛋白表达出来几乎全在包涵体里面，没有办法的。
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2楼2013-07-17 00:07:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-17 00:52:46
防止包涵体出现常用的方法：1.降低重组菌的生长温度是防止包涵体出现最常用的方法。低生长温度降低了无活性的聚集体的形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平降低，也可以减少包涵体的形成。2.在培养重组菌时提供丰富的培养，创造最好的培养条件，如：供氧充足、合适的pH值等，以减少包涵体的形成。3.添加可促进重组蛋白质可溶性表达生长添加剂，增加细胞的渗透压。4.在低浓度的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白质的表达量，也可减少包涵体的形成。5.利用硫氧还原蛋白融合表达或与目标蛋白质共表达，得到可溶性的蛋白质。6.筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白质可溶。7.与目标蛋白质共表达某些能够在目标蛋白质折叠过程中起作用的分子伴侣，得到得到可溶性的蛋白质。
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3楼2013-07-17 00:38:19
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hhxq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
南林大蕙: 金币+5, ★★★很有帮助, 能不能解释的更详细一点啊，我们用的载体是pET-20b，菌是BL21。 2013-07-17 09:32:56
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:43:39
个人觉得换载体表达比较有效。想pGEX以及SUMO等载体就能增加蛋白的可溶性。还有可以试试别的表达菌株，如transB就有利于含二硫键蛋白的折叠。
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4楼2013-07-17 09:14:16
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