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麦堂straw银虫 (小有名气)
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毕赤酵母表达培养基 已有1人参与
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| 毕赤酵母GS115对克隆进行表达过程中，一般使用的为BMGY/BMMY甲醇诱导培养，请教一下各位大侠，能否有更为简便的培养基，可以省略将BMGY换为BMMY的中间步骤，一步法达到表达效果（表达的为一种酶，因需进行大批量接种表达，对表达量要求不高只求简便易行）？ |
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reallpf
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【答案】应助回帖
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麦堂straw(amisking代发): 金币+3, 回答的非常不错。 2013-07-03 23:04:47
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麦堂straw(amisking代发): 金币+3, 回答的非常不错。 2013-07-03 23:04:47
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那你可以从两个角度来考虑： 1.换成组成型表达，比如pGAP启动子，毕赤酵母使用组成型表达启动子，对于有些酶可能比诱导型表达量还高。而且组成型表达的重组菌株，为了简单而且不考虑表达量的话，将是首选，可以直接利用YPD发酵3天左右即可。 2.如果必须用诱导型的启动子，而不想换培养基，那么只能利用发酵罐了。但是毕赤酵母在发酵罐上进行甲醇诱导表达，发酵周期比较长，约1周（初期生长半天，增殖约1天，甘油补料约1天，甲醇诱导约4天）。但是与摇瓶发酵相比，时间上没有太大差别。但是在发酵罐上进行毕赤酵母的甲醇诱导表达，需要严格调控甘油补料和甲醇诱导时间点，所以大概要守夜1~2晚。 因此，如果不考虑表达量，只为了简单，建议你选择组成型表达。市场上已经有非常成熟的pGAPZmazF系列载体，可以根据自己的实验情况选择。 |
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2楼2013-07-03 18:57:16
麦堂straw
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感谢回复。 我是建立了一个毕赤酵母转化子库（>10000个），从大量转化子中筛选目的转化子。克隆载体是已经构建好了的，为AOX启动子甲醇诱导表达，换启动子基本上没有可能。现只想寻求一高效简便的表达方法，因需对转化子库中每个转化子进行诱导表达确定表达产物是否有特异性状，所以利用发酵罐也不可能。想利用96孔板对每个转化子进行培养，之后筛选，但因BMGY/BMMY培养基过程中，需要离心去除BMGY后再加BMMY，对于大量筛选仍是显得十分不便。想请教的是，转化子在BMGY中培养一天后，如果不去除直接加甲醇诱导表达是否会影响很大，因BMMY与BMGY差别只在于一个是甲醇，一个是甘油。 因之前一直做的是分子生物载体构建之类工作，对酵母表达这块还是不太熟悉，望大侠不吝赐教，十分感谢！ |
3楼2013-07-03 21:24:31
reallpf
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【答案】应助回帖
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如果按照你说的，认为如果你直接添加甲醇需要做到两点： 1.甘油（即碳源）必须完全耗完，并且饥饿2小时以上，方能诱导成功。 2.摇瓶阶段之所以换培养基，主要还是最初的培养基的碳源与氮源比例问题，因此在后期补加甲醇的过程中，考虑加入一定量的氮源来补充氮源并平衡碳氮比。 针对你说的问题，想说的有2点： 1.换启动子还是比较简单，但需要你实验室有相关的实验基础，即将PCR产物直接转化毕赤酵母，相关的文章你可以搜索“PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库”一文，然后结合你自己的实际情况来做。 2.如果你使用96孔板培养，那么换培养基也非常容易操作。现在有离心机可以直接离心96孔板，然后更换培养基，这个方法更加容易。 |
4楼2013-07-04 19:07:09
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