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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母表达培养基
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麦堂straw

银虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母表达培养基 已有1人参与

毕赤酵母GS115对克隆进行表达过程中，一般使用的为BMGY/BMMY甲醇诱导培养，请教一下各位大侠，能否有更为简便的培养基，可以省略将BMGY换为BMMY的中间步骤，一步法达到表达效果（表达的为一种酶，因需进行大批量接种表达，对表达量要求不高只求简便易行）？
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山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
1楼 2013-07-02 22:19:19
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw(amisking代发): 金币+3, 回答的非常不错。 2013-07-03 23:04:47
那你可以从两个角度来考虑：

1.换成组成型表达，比如pGAP启动子，毕赤酵母使用组成型表达启动子，对于有些酶可能比诱导型表达量还高。而且组成型表达的重组菌株，为了简单而且不考虑表达量的话，将是首选，可以直接利用YPD发酵3天左右即可。

2.如果必须用诱导型的启动子，而不想换培养基，那么只能利用发酵罐了。但是毕赤酵母在发酵罐上进行甲醇诱导表达，发酵周期比较长，约1周（初期生长半天，增殖约1天，甘油补料约1天，甲醇诱导约4天）。但是与摇瓶发酵相比，时间上没有太大差别。但是在发酵罐上进行毕赤酵母的甲醇诱导表达，需要严格调控甘油补料和甲醇诱导时间点，所以大概要守夜1~2晚。

因此，如果不考虑表达量，只为了简单，建议你选择组成型表达。市场上已经有非常成熟的pGAPZmazF系列载体，可以根据自己的实验情况选择。
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麦堂straw
2楼2013-07-03 18:57:16
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 麦堂straw at 2013-07-03 21:24:31
感谢回复。
我是建立了一个毕赤酵母转化子库（>10000个），从大量转化子中筛选目的转化子。克隆载体是已经构建好了的，为AOX启动子甲醇诱导表达，换启动子基本上没有可能。现只想寻求一高效简便的表达方法，因 ...

如果按照你说的，认为如果你直接添加甲醇需要做到两点：

1.甘油（即碳源）必须完全耗完，并且饥饿2小时以上，方能诱导成功。

2.摇瓶阶段之所以换培养基，主要还是最初的培养基的碳源与氮源比例问题，因此在后期补加甲醇的过程中，考虑加入一定量的氮源来补充氮源并平衡碳氮比。

针对你说的问题，想说的有2点：

1.换启动子还是比较简单，但需要你实验室有相关的实验基础，即将PCR产物直接转化毕赤酵母，相关的文章你可以搜索“PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库”一文，然后结合你自己的实际情况来做。

2.如果你使用96孔板培养，那么换培养基也非常容易操作。现在有离心机可以直接离心96孔板，然后更换培养基，这个方法更加容易。
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4楼2013-07-04 19:07:09
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