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hua_geduo木虫 (正式写手)
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[求助]
细胞培养的血清问题
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| 细胞培养的血清500ml，没有完全融化我就把已经融化的部分进行了分装,拿来使用，是不是这样的血清不均匀?这样会不会对细胞有影响？这几天发现细胞总会脱落，会不会跟这个有关？ |
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 细胞培养 |
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hua_geduo
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myprayer
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-06-30 16:21:41
hua_geduo: 金币+3, ★有帮助 2013-07-01 20:55:18
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这个是细胞培养的一般方法，大概就是这个流程吧 具体的你的问题我再给你说一下 培养基的配置那DMEM为例 先是溶解相应的碳酸氢钠，然后加入培养基，等充分溶解之后过滤，过滤最好都到无菌环境中进行， PVDF 0.22um的材质过滤器 然后将你所用的血清加入到已经过滤好的培养基中，稍微轻轻的摇晃让其均匀，然后分装在50ML的离心管中这步你看实验室需求了，这样分装的目的能够减少整体污染。 配置培养基大概就是这样子的。 再来说说你的问题 你说细胞脱落，是细胞贴壁贴的不好吗？这个要看你具体是什么细胞了。 下面给你说的是细胞培养的大概步骤 感觉你说的问题就是没有搞清楚流程，没见过直接用血清那样子用的 1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上; 2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存; 4.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存; 5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌).至少每月一次. 6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点. 复苏: 1. 应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化. 2. 2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养. 传代: 1.贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验. 悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心500rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养. [ Last edited by myprayer on 2013-6-30 at 16:02 ] |
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