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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 293A细胞培养出了问题
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geryss

新虫 (小有名气)

[求助] 293A细胞培养出了问题

养过细胞的前辈和高手和路过的大侠给支个招吧，不胜感激
本人养293A用于腺病毒扩增，可是老养不好。
我从同学那借来一盘（10mm大小）长势良好的293A，汇合度80%时准备传代。0.25%胰酶，DMEM+10%FBS,已放至室温。
在超净台里，去除培液，用PBS润洗两次，加1ml胰酶，消化30s，加培液终止消化，用移液枪小心吹打，混匀，1：3传代，每盘加6ml培液，6小时后贴壁，有一定形态，两天后细胞稍微长大一点，但不久有漂浮的细胞和少量碎屑，培液明亮无污染，三天后细胞全部变圆漂浮。
请问我该怎么改进，才能养好呢？
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
1楼 2013-05-01 20:18:19
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yingfang

铁虫 (初入文坛)
有可能是缺乏营养，你再加点小牛血清试试看
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2楼2013-05-02 09:23:32
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geryss

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingfang at 2013-05-02 09:23:32
有可能是缺乏营养，你再加点小牛血清试试看

我们这都用这样的血清比例啊，他们的都养的好好的啊，我再试试
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
3楼2013-05-02 15:55:18
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yakir

银虫 (小有名气)
你们用的皿是一次性的还是自己泡酸的，自己泡酸的话没洗干净可能会出现这种状况。
胰酶处理30S后操作要稍微快点。
你的细胞情况是6小时后贴壁还可以，而且也形成了一定的形态，证明早期可能处理没有什么问题。悬浮发生在后期培养，那就要考虑你后期培养的相关条件了，温度的稳定性（是否有波动），CO2浓度，还有你的血清有没有问题，培养基是自己配制的还是买的成品。。。
还有一种情况是支原体污染，显微镜观察不到的，细胞生长很缓慢，细胞出现死亡，这个情况一般概率比较低，发生了就很难处理，希望别是。。。。
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一步一步！
4楼2013-05-02 17:18:15
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geryss

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yakir at 2013-05-02 17:18:15
你们用的皿是一次性的还是自己泡酸的，自己泡酸的话没洗干净可能会出现这种状况。
胰酶处理30S后操作要稍微快点。
你的细胞情况是6小时后贴壁还可以，而且也形成了一定的形态，证明早期可能处理没有什么问题。悬浮 ...

我胰酶处理后为节省时间没有把胰酶去除就直接加培液终止消化了，然后用枪头吹打，会不会对细胞有损害，温度，二氧化碳浓度没有变过，血清GIBCO等都和其他人的一样，培养基是赛默飞成品的,支原体污染？不会吧，我可是从同学那借了三次细胞，每次都是新的细胞，不会每次都污染吧，还有一次细胞漂浮4-5天，我也没心思管它，等我扔掉它时也没有污染的迹象啊？
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
5楼2013-05-03 08:18:50
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geryss

新虫 (小有名气)
所有试验所用用品都是一次性的
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
6楼2013-05-03 08:20:58
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yakir

银虫 (小有名气)
你加完胰酶后显微镜下观察细胞变圆就可以了，加培养基终止，然后小心吹打混匀，移入离心管800rpm，
1-2min，移除上清，加新鲜培养基，再分皿试试；或者等细胞贴壁了再换下培养基。有可能是胰酶里面的EDTA对细胞贴壁产生了影响，你大概多久换次液？
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7楼2013-05-03 08:51:59
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geryss

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by yakir at 2013-05-03 08:51:59
你加完胰酶后显微镜下观察细胞变圆就可以了，加培养基终止，然后小心吹打混匀，移入离心管800rpm，
1-2min，移除上清，加新鲜培养基，再分皿试试；或者等细胞贴壁了再换下培养基。有可能是胰酶里面的EDTA对细胞贴壁 ...

来不及镜下观察啊，时间稍久就会消化过度，离心不好的对293A伤害很大，换液？合适的密度传代的话，2天左右就长满了，不用换液的
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
8楼2013-05-03 12:20:06
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yakir

银虫 (小有名气)
略微变圆就立即超净台操作来得及的，不然这个反应30S的时间大家是怎么得到的呢，呵呵。。
800rpm离心对基本没什么影响的，不然冻存的话怎么提高细胞密度？如果你不放心的话就等细胞贴壁一段时间再换下液。你现在细胞一天后悬浮，外界环境你已经说了没问题，那就是培养皿内部的问题，DMEM和FBS都是成品的，那溶液里面就没有什么可疑的了，EDTA影响的可能性最大，所以才需要你换液的。。。。
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一步一步！
9楼2013-05-03 13:30:31
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geryss

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yakir at 2013-05-03 13:30:31
略微变圆就立即超净台操作来得及的，不然这个反应30S的时间大家是怎么得到的呢，呵呵。。
800rpm离心对基本没什么影响的，不然冻存的话怎么提高细胞密度？如果你不放心的话就等细胞贴壁一段时间再换下液。你现在细 ...

嗯，前两条想想还是可以做到的，EDTA? 我只用了0.25%的成品胰酶，没有EDTA的，我看我还是把消化后的胰酶倒掉得了。谢谢你的帮助，请回复应助贴，我好奉上金币啊，
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未出土时便有节，到凌云处尚虚心
10楼2013-05-03 14:56:36
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