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geryss

新虫 (小有名气)

[求助] 293A细胞培养出了问题

养过细胞的前辈和高手和路过的大侠给支个招吧,不胜感激
本人养293A用于腺病毒扩增,可是老养不好。
我从同学那借来一盘(10mm大小)长势良好的293A,汇合度80%时准备传代。0.25%胰酶,DMEM+10%FBS,已放至室温。
在超净台里,去除培液,用PBS润洗两次,加1ml胰酶,消化30s,加培液终止消化,用移液枪小心吹打,混匀,1:3传代,每盘加6ml培液,6小时后贴壁,有一定形态,两天后细胞稍微长大一点,但不久有漂浮的细胞和少量碎屑,培液明亮无污染,三天后细胞全部变圆漂浮。
请问我该怎么改进,才能养好呢?
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未出土时便有节,到凌云处尚虚心
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yakir

银虫 (小有名气)

你加完胰酶后显微镜下观察细胞变圆就可以了,加培养基终止,然后小心吹打混匀,移入离心管800rpm,
1-2min,移除上清,加新鲜培养基,再分皿试试;或者等细胞贴壁了再换下培养基。有可能是胰酶里面的EDTA对细胞贴壁产生了影响,你大概多久换次液?
一步一步!
7楼2013-05-03 08:51:59
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yingfang

铁虫 (初入文坛)

有可能是缺乏营养,你再加点小牛血清试试看
2楼2013-05-02 09:23:32
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geryss

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yingfang at 2013-05-02 09:23:32
有可能是缺乏营养,你再加点小牛血清试试看

我们这都用这样的血清比例啊,他们的都养的好好的啊,我再试试
未出土时便有节,到凌云处尚虚心
3楼2013-05-02 15:55:18
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yakir

银虫 (小有名气)

你们用的皿是一次性的还是自己泡酸的,自己泡酸的话没洗干净可能会出现这种状况。
胰酶处理30S后操作要稍微快点。
你的细胞情况是6小时后贴壁还可以,而且也形成了一定的形态,证明早期可能处理没有什么问题。悬浮发生在后期培养,那就要考虑你后期培养的相关条件了,温度的稳定性(是否有波动),CO2浓度,还有你的血清有没有问题,培养基是自己配制的还是买的成品。。。
还有一种情况是支原体污染,显微镜观察不到的,细胞生长很缓慢,细胞出现死亡,这个情况一般概率比较低,发生了就很难处理,希望别是。。。。
一步一步!
4楼2013-05-02 17:18:15
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