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qiuyunhen

金虫 (小有名气)

[求助] PCR引物GC含量过低时候,如何调整PCR体系?

引物设计时候,一条引物CG含量55%,另一条只36%,这会不会影响PCR?做了三次PCR都没有任何条带。如何对PCR条件进行优化?
另外,两引物5"端添加酶切位点之后,引物的Tm值发生变化,并可能会发生错配,影响PCR产物的生成。如何对PCR条件进行优化?
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纳米之心

木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-04 19:22:04
GC含量低会导致引物耐高温能力下降,可能需要对PCR对的温度进行优化,或者在可能情况下,用一定量的GC替代AT!!!
火星人要回火星了!!!
2楼2013-05-04 16:37:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:39:24
qiuyunhen: 金币+4 2013-08-14 22:29:43
你PCR的模板是什么?你做PCR的目的是什么?设计引物的时候,上下游引物的GC含量相差尽量 不要太大,你接下来可以试下touchdown。
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-05-04 19:23:28
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-05 16:52:30
如果不想麻烦就touchdown PCR,如果求稳当设置梯度PCR,温度上下限时你两条引物的温度
4楼2013-05-04 20:39:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


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qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-05 16:52:21
一般GC含量低的话把引物序列设计稍微长一点,就可以补偿Tm低的问题。你说的百分比差别也不是那么大。如果两个引物的tm不同,按照低的考虑PCR的退火温度。加酶切位点的引物的Tm需要按照不包含酶切位点的序列计算。
5楼2013-05-05 03:03:58
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xikexiao

禁虫 (小有名气)


感谢参与,应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-05 16:52:47
本帖内容被屏蔽

6楼2013-05-05 10:22:57
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scilencing

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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试试梯度PCR的策略
7楼2013-05-06 16:14:21
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