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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物GC含量过低时候，如何调整PCR体系？
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qiuyunhen

金虫 (小有名气)

[求助] PCR引物GC含量过低时候，如何调整PCR体系？

引物设计时候，一条引物CG含量55%，另一条只36%，这会不会影响PCR？做了三次PCR都没有任何条带。如何对PCR条件进行优化？
另外，两引物5"端添加酶切位点之后，引物的Tm值发生变化，并可能会发生错配，影响PCR产物的生成。如何对PCR条件进行优化？
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知识与经验是成长的基础
1楼 2013-05-04 13:54:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-05 16:52:21
一般GC含量低的话把引物序列设计稍微长一点，就可以补偿Tm低的问题。你说的百分比差别也不是那么大。如果两个引物的tm不同，按照低的考虑PCR的退火温度。加酶切位点的引物的Tm需要按照不包含酶切位点的序列计算。
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5楼2013-05-05 03:03:58
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纳米之心

木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 19:22:04
GC含量低会导致引物耐高温能力下降，可能需要对PCR对的温度进行优化，或者在可能情况下，用一定量的GC替代AT！！！
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火星人要回火星了！！！
2楼2013-05-04 16:37:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 10:39:24
qiuyunhen: 金币+4 2013-08-14 22:29:43
你PCR的模板是什么？你做PCR的目的是什么？设计引物的时候，上下游引物的GC含量相差尽量 不要太大，你接下来可以试下touchdown。
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-05-04 19:23:28
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
qiuyunhen(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-05 16:52:30
如果不想麻烦就touchdown PCR，如果求稳当设置梯度PCR，温度上下限时你两条引物的温度
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4楼2013-05-04 20:39:17
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