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小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 【请教大家】毕赤酵母诱导完毕跑SDS电泳上清和沉淀都几乎没有任何条带..

各位亲们，这几天做了毕赤酵母的诱导表达，表达完后将上清和沉淀都用loading buffer处理100℃煮沸10min跑电泳，发现参照什么条带也没有，其他样品沉淀也没有条带，上清中也只是微微的一个带，且不是我的蛋白大小，如图所示，希望大家帮我分析一下，不胜感激

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做出色的科研人
1楼 2013-04-23 10:12:45
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
此外，参照和样品都检测到了一定的活性，在液相下。
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做出色的科研人
2楼2013-04-23 10:14:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+2, ★有帮助, 你是说煮沸有问题？上了20ul 不少吧？ 2013-04-23 16:18:46
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-24 08:39:39
觉得是细胞破碎有问题，或者是上样量不够。
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3楼2013-04-23 14:49:38
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
4楼2013-04-23 21:14:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 14:49:38
觉得是细胞破碎有问题，或者是上样量不够。

你用了多少细胞，用多少体积的loading buffer煮的？
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5楼2013-04-24 03:48:21
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-24 03:48:21
你用了多少细胞，用多少体积的loading buffer煮的？...

200ul上清+30ul loading buffer 上样20ul
1ml沉淀用120ul loading buffer 上样5ul
都煮沸了10min
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做出色的科研人
6楼2013-04-24 10:26:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小科研女dow at 2013-04-24 10:26:38
200ul上清+30ul loading buffer 上样20ul
1ml沉淀用120ul loading buffer 上样5ul
都煮沸了10min...

不知道为什么没有带，至少应该有酵母本身的蛋白吧。一般用loading buffer煮沸应该没有问题。确定煮沸前沉淀样品完全重悬在buffer里了吗？不行的话试试加大上样量。
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7楼2013-04-24 12:51:56
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heroxuning

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+5, ★★★很有帮助, 嘿嘿额 谢啦 2013-04-24 20:23:33
胞内裂解不完全，核酸过多，另外上样量可能过多，跑出条带糊状
上清，酵母很多外源蛋白表达量都很低，胞外分泌的本底蛋白也很少，所以没有明显条带也很正常。可以考虑用TCA浓缩后上样。
我们实验室胞内裂解样是这样做的：1ml菌液离心，上清和菌体分开。菌体用1ml PBS重悬，取200ul 菌悬液+50ul 5*loading buffer  煮15-20min，12000rpm 离心10min
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8楼2013-04-24 14:20:28
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heroxuning

木虫 (正式写手)
胞内上样量8ul
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9楼2013-04-24 14:21:22
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heroxuning

木虫 (正式写手)
上清我们上样30ul
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10楼2013-04-24 14:22:05
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