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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白电泳图分析求教

想把蛋白切胶,原先的蛋白是包涵体,在尿素中的。所以先过夜透析(共17小时),浓缩后上样跑胶,结果图很奇怪。目的蛋白条带极弱(胶图上从上到下第一条带是目的带),与检测的浓度不符,测的浓度大约800ug/ml左右,上样300ul,但是从图上看根本没那么多蛋白。而且胶的下缘一大片不知道是什么,是尿素没透干净吗?浓缩后也发现有很多白色絮状的东西析出来,煮样后又溶解了,我原来以为是蛋白呢,现在看来应该不是。求各位赐教!还有,请有经验的同志帮忙目测下我的目的蛋白总共有多少?拜托各位啦!(注:胶是1.5mm厚的那种,没插梳子,用于切胶)

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panyuzhu

禁虫 (小有名气)

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weizhi111: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-20 22:10:17
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2楼2013-04-20 21:36:02
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-04-20 21:36:02
图丑的真是惨不忍睹。
1.跑胶不带marker
2.实验想的简单,你为什么不做一个预实验,二直接把所有的样品全部点完
3.蛋白定量,你是用什么方法的,你知道每种方法干扰物质吗?
4.你上样缓冲液或者样品离子强度绝对 ...

谢谢这位高手的指教,关于你指出的问题,是这样的:
1.因为是想切胶回收的,所以没用带齿的梳子,没点marker,我在跑这块胶的同时跑了一块带marker的胶,条带跟这块胶差不多,而且根据大小来看,图上比较弱的那条带就是我的目的带;
2.实验样品没有全部点完,还剩一半;
3.定量时用了BCA法和Bradford,我看了说明书,我的蛋白是用PBS透析过的,理论上不会干扰定量蛋白。当然也要请教各位是不是透析的还是不充分,导致了样品中有干扰物质;
4.上样缓冲液一直用的是这一管,另一块同时跑的胶上也用了一样的缓冲液,其他样品没有问题。
3楼2013-04-20 22:19:57
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菱霖飞飞飞

新虫 (初入文坛)

我觉得你极有可能是在透析的过程中蛋白沉淀了,极有可能是沉淀在透析袋上,bradford法检测浓度时试试先4℃离心10min后取上清再测,如果离心后所测上清的浓度明显下降了,就应该是蛋白沉淀了以小颗粒的形式悬浮在溶剂中导致还是能测得到浓度,建议你试试,另外想请教您一下您是如何上传这张图片的?我想发帖但是上传不了图片
4楼2019-07-08 15:49:05
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