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变心的翅膀

木虫 (小有名气)

[求助] cDNA扩增效率如何优化。

各位虫友,我现在准备测序一个编码已知蛋白的端的DNA序列,我提取了mRNA(质量没有问题,尝试扩增其他基因都没有问题),然后逆转录为cDNA,以cDNA为模板扩增约1500bp的序列,每次扩增后条带都很淡,优化了很多条件还是不行(这个基因表达相对较低,但是可以检测到蛋白),我怎么才能使PCR扩增效率提高啊,希望各位虫友能都给予指点,非常感谢。
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男儿当自强
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

两个方法,1、优化PCR条件,因为你的片段比较长,你PCR的时候要多加点模板,把PCR体系放大一点,比如用50ul PCR体系,还有你的延伸时间放长一点,放到4-5分钟都没有问题的,循环数可以放到36个循环,这样扩增效率会高一点。
2、干脆不要优化PCR体系了,用一个巢式PCR多好,巢式PCR第二轮能得到巨量的片段!!
用心
2楼2013-10-16 15:45:00
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