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变心的翅膀

木虫 (小有名气)

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[求助] cDNA扩增效率如何优化。

各位虫友，我现在准备测序一个编码已知蛋白的端的DNA序列，我提取了mRNA(质量没有问题，尝试扩增其他基因都没有问题)，然后逆转录为cDNA,以cDNA为模板扩增约1500bp的序列，每次扩增后条带都很淡，优化了很多条件还是不行（这个基因表达相对较低，但是可以检测到蛋白），我怎么才能使PCR扩增效率提高啊，希望各位虫友能都给予指点，非常感谢。

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男儿当自强

1楼2013-04-08 20:54:42

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taccycle

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

两个方法，1、优化PCR条件，因为你的片段比较长，你PCR的时候要多加点模板，把PCR体系放大一点，比如用50ul PCR体系，还有你的延伸时间放长一点，放到4-5分钟都没有问题的，循环数可以放到36个循环，这样扩增效率会高一点。
2、干脆不要优化PCR体系了，用一个巢式PCR多好，巢式PCR第二轮能得到巨量的片段！！

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用心

2楼2013-10-16 15:45:00

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