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gaojuan1985新虫 (正式写手)
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细菌基因文库建立时，克隆非常少！
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我在做一个革兰氏阳性菌的基因文库的建立。但是做了两次，发现转化后长出的克隆非常少，只有几十个。我把实验方法写出来，希望大家给意见！ 1. 细菌基因组的提取：用天根细菌基因组提取试剂盒进行提取，得到的基因组大小是大于12 kb（用的1 kb plus DNA ladder，最大只能显示到12 kb）。浓度为230 ng/ul，260/280=1.80 2.细菌基因组的不完全酶切：采用Sau 3AI进行不完全酶切。方法为80 ul的体系中，Sau 3AI 为0.1 U/ug DNA, 基因组DNA为6 ug。37度切20 min。然后切胶回收。Fig. 1分别是marker，提取的基因组DNA，Sau 3AI酶切后。 3. 载体pUC19的处理：pUC19用BamHI单酶切后，用CIAP处理。这里有一个问题，我们实验室都是往酶切体系中直接加入CIAP处理的，不知道这样行不行？具体操作为20 ul的酶切体系中有4 ug的pUC19以及1.5 ul的BamHI，酶切2 h后，加入1 ul TAKARA的CIAP，37度1 h，然后切胶回收。Fig. 2是pUC19酶切前和酶切后的对比。 4.连接：将pUC19 （28 ng）和基因组Sau 3AI酶切后的切胶回收片段（2-5 kb，22 ng/ul, 7.5 ul,总量约为150 ng）进行连接，连接体系为10 ul，16度连接16 h左右。 5. 转化：将10 ul连接产物转入100 ul DH5a中，采用热转。 6. 涂板：分别涂了200 ul、300 ul、600 ul。 结果：只有几十个菌落。 对照试验：用pUC19质粒转化证明DH5a感受态没问题。用pUC19/BamHI/CIAP处理后的线性质粒（56 ng）自连，做转化，1 ml全部涂布后，也长出几十个菌落。 现在就是觉得肯定是某一步没掌握好，但是具体是哪一步也搞不清楚。希望大家多多发挥自己的智慧，给我提出宝贵意见啊   Fig 1.Jpg |
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2013-04-01 08:39:42, 26.44 K
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