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piscesghost金虫 (小有名气)
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[求助]
酵母克隆PCR技术求助
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本人最近在做酵母克隆PCR，现在是pPICZaA载体转入GS115，挑克隆于YPD中过夜后PCR鉴定，取约100ul菌液离心，用ddH2O重悬后先100度10min，然后-80度10min，重复3次，离心取上清PCR，但是最近一直P不出来，或者条带很浅，设置的程序是94度10min，94度45s，50度45s，72度1min，72度5min，35个循环。 请教做过酵母的高人指点，怎样才能做好酵母克隆的PCR鉴定？？ 因为克隆数较多，要筛选的数量也较多，直接提基因组工作量太大，而且菌落PCR鉴定也只是一个初筛。之前用pPIC9K转化的GS115和KM71时，做菌落PCR基本能P出条带，但是现在突然P不出来了，所用冻融条件，PCR体系，程序等等条件都基本一致。还请高人指点，不胜感激！！ |
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