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gaojuan1985新虫 (正式写手)
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[求助]
关于细菌基因文库的建立及酶的筛选，新手，请各位指教！
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大家好！ 我手头有一个细菌，是从土壤中筛选出来的，能分泌我所需要的酶。该细菌我进行了16S rDNA测序，发现目前还没有它的全基因组序列。但是我想得到我的酶的基因信息，因此想通过基因文库的方法。但是本人新手，看了一些资料，有很多问题不明，特此请教： 1：基因组DNA的处理：有的用Sau 3AI进行部分酶切，有的用物理方法进行断裂，还有其它限制性内切酶处理等。我根据经验推测我的目的基因ORF大概在2 kb左右，因此，我该把基因组DNA切到多大比较合适？各位可否给个protocol？切多久？酶量？等等 2：载体的选择：目前手头只有质粒，所以想先尝试一下质粒，fosmid和cosmid往后排，呵呵。那么质粒该选用哪种？我看有用pUC18的，也有用pET系列的。各有何优缺点呢？ 3：重组克隆的计数：弱弱地问一下，1万个克隆的话，怎么计算出来的？难道一个一个数出来的？还有，怎么保存这些重组克隆呢？ 问题较多，请多赐教。金币有限，但是与大家交流沟通的心无限，呵呵，谢谢啦  |
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