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至尊木虫 (文坛精英)

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[求助] 求助设计引物时酶切位点保护碱基的问题

限制性内切酶酶切位点保护碱基不全时如何确定切割率？例如Kpn I 酶切位点是GGTACC 前面加完保护碱基G,后面加完保护碱基C的“GGGTACCC” 它的2h和20h的切割率都是0，别人给我设计的引物只加了前面保护碱基G,后面没有加C，是 GGGGTACC，那切割率是多少呢？会不会根本切不开啊？

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1楼 2013-02-20 14:21:47

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imyting

至尊木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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保护碱基的一个非常重要的作用是在限制性内切酶结合靶DNA时起支架作用，酶都有自己特有的识别位点以及切割位点，而所谓的酶切位点只是切割位点；为了便于酶与靶DNA的结合，在切割位点周围必须有一定长度的DNA序列供酶结合。所以对于环形DNA（如环形质粒）来说，切割效率都是十分高的，因为切割位点两边的序列长度很长。而对于设计PCR引物来说则不然，PCR之后5‘端是末端，所以设计引物时必须要加保护碱基，而且理论上是越长越利于后面的酶切（前提是不影响PCR）。所以引物的3’端是不需要加保护碱基的，因为PCR会延伸。另外，这种表每个生产限制性内切酶的公司可能不太一样，用哪个公司的酶最好参考那个公司的标准，基本上只要长度达到了就没问题。从你上面那个表来看，这个酶是很好切的，但是至少得在5‘端加两个保护碱基，加一个估计会切不开（说效率低都是比较保守了）。