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10kd 和100kd的蛋白同时做western blot 已有1人参与
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最近在做基因可变剪切的验证实验，预测目标蛋白可变剪切后编码蛋白只有10多KD，而野生型蛋白则有100kd，用常规12%的SDS-PAGE做的WB，结果发现20KD以下就不存在目的片段（PVDF是0.45的，bio-rad湿转，转膜时间是100v*1.5h），是我的转膜时间太长了？PVDF膜孔径太大了？还是要专门的试验方法？ 有谁做过类似实验，给个建议！ |
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宁夏8083
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-02-01 07:49:29
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wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-02-01 07:49:29
| 用12%的胶跑是没有问题的，我以前跑14KD的蛋白都不会转过头。同时你做WB会有预染的蛋白MARKER的，最小的分子量应该在10-12KD左右，分离胶的时候可以看到是否最小的marker在最前沿，（当然要比溴酚蓝慢）然后转膜时间也没有问题，0.45的可能大了点，试试0.22的吧。再有就是你转膜后，可以先看最小的marker是否在膜上，如果在，就用丽春红溶液染一下，可以看到你的目的蛋白条带是否存在，用TBS洗掉，不会耽误后面的抗体结合的。 |
章信来7楼2013-01-30 11:34:04
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