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章信来

木虫 (正式写手)

[求助] 10kd 和100kd的蛋白同时做western blot 已有1人参与

最近在做基因可变剪切的验证实验,预测目标蛋白可变剪切后编码蛋白只有10多KD,而野生型蛋白则有100kd,用常规12%的SDS-PAGE做的WB,结果发现20KD以下就不存在目的片段(PVDF是0.45的,bio-rad湿转,转膜时间是100v*1.5h),是我的转膜时间太长了?PVDF膜孔径太大了?还是要专门的试验方法?
有谁做过类似实验,给个建议!
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章信来

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-01-28 20:31:02
试试缩短转膜时间,我用PVDF,半干法,10 V,1 h,可以同时做出来80 kD和17 kD的

谢谢,我今天就尝试下!
3楼2013-01-29 10:58:20
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励回答 常来啊 2013-01-28 22:41:26
试试缩短转膜时间,我用PVDF,半干法,10 V,1 h,可以同时做出来80 kD和17 kD的
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2013-01-28 20:31:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-02-01 07:49:42
小蛋白比大蛋白跑得快,无论是电泳还是转膜的时候。觉得你可以做一个10-16%的梯度胶。小蛋白从浓度相对较高的胶里转出来速度会减慢一些。
4楼2013-01-30 09:29:01
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章信来

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-30 09:29:01
小蛋白比大蛋白跑得快,无论是电泳还是转膜的时候。觉得你可以做一个10-16%的梯度胶。小蛋白从浓度相对较高的胶里转出来速度会减慢一些。

嗯,有道理,不过貌似从没做过梯度胶,没有特殊的灌胶设备能否制胶啊?
5楼2013-01-30 10:29:36
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