应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接
161/2返回列表12下一页
查看: 2758  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步：从测序成功的质粒上酶切出目的基因，凝胶回收。
第二步：把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点，凝胶回收。
第三部：用高效连接酶连接后转化DH5a
结果：转化效率很高，但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的，但是···为什么总是不对呢？
最近做的甚是苦逼，诸位大侠帮帮小弟吧。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢
1楼 2013-01-09 19:54:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-10 23:09:46
天使1Q86之城: 金币+2, Thank you 2013-01-14 01:13:33
酶切时间只是一个方面。
酶切设计时需要明确：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug质粒DNA就足够了），DNA的质量（一般，按照质粒试剂盒的标准方法制备的质粒还是可以的，但如果培养时间过长，或制备质粒时不规范，容易导致质粒酶切不完全），限制性 内切酶的用量。
从你描述的情况来看，可能是你的质粒DNA酶切不完全（即存在大量的单酶切产物，而单酶切载体是最容易自连，而形成背景克隆）。验证酶切是否彻底的一个方法就是设计一个载体的自连实验（即在连接反应中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的载体处理得不好。
其实对你的实验设计进行量化是提高克隆效率的一个很重要的手段，包括：对质粒定量（浓度，纯度等），精确计算酶切所需的酶等。建议你借助doulbe digeston designer进行双酶切设计。你可以在小木虫上搜到其链接。对初学者很有帮助。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2013-01-09 21:57:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是单酶切还是双酶切？单酶切的话载体最好用磷酸酶处理去5'P，避免载体自连。如果是双酶切，确定两个酶的用量，是否都切割完全。既然是从胶上回收的，应该不会把没有切动的质粒回收下来的，可能是有一个酶作用不完全。做酶切的载体质粒和带目的片段的质粒最好定量，可以使酶切更完全有效，也可以避免酶过多产生星活性。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-01-10 07:18:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。
赞一下 回复此楼
2楼2013-01-09 20:03:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-09 20:38:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hubohuna

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的，质粒最好切通宵，因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了，但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了，所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性，肯定是质粒没切充分。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-09 20:56:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用胶回收我就不谈酶切问题了，建议你做连接时，做几个不同的时间段，1,4,8，o/n. 再做转化，祝你好运！
赞一下 回复此楼
shine
7楼2013-01-10 10:57:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang881007

金虫 (小有名气)
忘了一点，质粒与插入片段比列也改变一下，减少质粒量试试。
赞一下 回复此楼
shine
8楼2013-01-10 10:58:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

honey倩

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。...

我们实验室也是Fermentas的酶，但是还是用的传统的酶，快酶不咋好用呢…
赞一下 回复此楼
当你的眼泪忍不住要流出来的时候，睁大眼睛，千万别眨眼，你会看到世界由清晰到模糊的全过程~~
9楼2013-01-10 15:28:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdmmore

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前也遇到相同问题，转化率挺高，但没有阳性克隆，可以试试分步酶切，保证每个酶都起作用，保证双酶切
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-10 17:14:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天使1Q86之城 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 wsYGJnURYvm6 2026-08-31 3/150 2026-09-01 01:52 by o3EMxHUAQDtS
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 wsYGJnURYvm6 2026-08-31 3/150 2026-09-01 01:40 by o3EMxHUAQDtS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 EZ67DG6CvcKL 2026-08-31 4/200 2026-09-01 01:30 by o3EMxHUAQDtS
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-31 21:30 by xiangy672
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 5/250 2026-08-31 14:40 by hahaboy
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭