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[求助]
酶切连接
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第一步：从测序成功的质粒上酶切出目的基因，凝胶回收。 第二步：把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点，凝胶回收。 第三部：用高效连接酶连接后转化DH5a 结果：转化效率很高，但是没有阳性克隆。 正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的，但是···为什么总是不对呢？ 最近做的甚是苦逼，诸位大侠帮帮小弟吧。 |
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 分子生化实验经验积累 |
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酶切专家
金虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-10 23:09:46
天使1Q86之城: 金币+2, Thank you 2013-01-14 01:13:33
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酶切时间只是一个方面。 酶切设计时需要明确：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug质粒DNA就足够了），DNA的质量（一般，按照质粒试剂盒的标准方法制备的质粒还是可以的，但如果培养时间过长，或制备质粒时不规范，容易导致质粒酶切不完全），限制性 内切酶的用量。 从你描述的情况来看，可能是你的质粒DNA酶切不完全（即存在大量的单酶切产物，而单酶切载体是最容易自连，而形成背景克隆）。验证酶切是否彻底的一个方法就是设计一个载体的自连实验（即在连接反应中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的载体处理得不好。 其实对你的实验设计进行量化是提高克隆效率的一个很重要的手段，包括：对质粒定量（浓度，纯度等），精确计算酶切所需的酶等。建议你借助doulbe digeston designer进行双酶切设计。你可以在小木虫上搜到其链接。对初学者很有帮助。 |
5楼2013-01-09 21:57:15
2楼2013-01-09 20:03:55
3楼2013-01-09 20:38:45
4楼2013-01-09 20:56:12
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