| 查看: 2485 | 回复: 15 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
酶切连接
|
|||
|
第一步：从测序成功的质粒上酶切出目的基因，凝胶回收。 第二步：把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点，凝胶回收。 第三部：用高效连接酶连接后转化DH5a 结果：转化效率很高，但是没有阳性克隆。 正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的，但是···为什么总是不对呢？ 最近做的甚是苦逼，诸位大侠帮帮小弟吧。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有277人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有15人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-10 23:09:46
天使1Q86之城: 金币+2, Thank you 2013-01-14 01:13:33
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-10 23:09:46
天使1Q86之城: 金币+2, Thank you 2013-01-14 01:13:33
|
酶切时间只是一个方面。 酶切设计时需要明确：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug质粒DNA就足够了），DNA的质量（一般，按照质粒试剂盒的标准方法制备的质粒还是可以的，但如果培养时间过长，或制备质粒时不规范，容易导致质粒酶切不完全），限制性 内切酶的用量。 从你描述的情况来看，可能是你的质粒DNA酶切不完全（即存在大量的单酶切产物，而单酶切载体是最容易自连，而形成背景克隆）。验证酶切是否彻底的一个方法就是设计一个载体的自连实验（即在连接反应中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的载体处理得不好。 其实对你的实验设计进行量化是提高克隆效率的一个很重要的手段，包括：对质粒定量（浓度，纯度等），精确计算酶切所需的酶等。建议你借助doulbe digeston designer进行双酶切设计。你可以在小木虫上搜到其链接。对初学者很有帮助。 |
5楼2013-01-09 21:57:15
2楼2013-01-09 20:03:55
3楼2013-01-09 20:38:45
4楼2013-01-09 20:56:12
