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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步：从测序成功的质粒上酶切出目的基因，凝胶回收。
第二步：把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点，凝胶回收。
第三部：用高效连接酶连接后转化DH5a
结果：转化效率很高，但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的，但是···为什么总是不对呢？
最近做的甚是苦逼，诸位大侠帮帮小弟吧。
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分子生化实验经验积累

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1楼 2013-01-09 19:54:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-10 23:09:46
天使1Q86之城: 金币+2, Thank you 2013-01-14 01:13:33
酶切时间只是一个方面。
酶切设计时需要明确：你酶切的DNA量（一般克隆1-2ug质粒DNA就足够了），DNA的质量（一般，按照质粒试剂盒的标准方法制备的质粒还是可以的，但如果培养时间过长，或制备质粒时不规范，容易导致质粒酶切不完全），限制性 内切酶的用量。
从你描述的情况来看，可能是你的质粒DNA酶切不完全（即存在大量的单酶切产物，而单酶切载体是最容易自连，而形成背景克隆）。验证酶切是否彻底的一个方法就是设计一个载体的自连实验（即在连接反应中用水代替你的克隆基因片段），如果形成大量的克隆，就表明你的载体处理得不好。
其实对你的实验设计进行量化是提高克隆效率的一个很重要的手段，包括：对质粒定量（浓度，纯度等），精确计算酶切所需的酶等。建议你借助doulbe digeston designer进行双酶切设计。你可以在小木虫上搜到其链接。对初学者很有帮助。
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5楼2013-01-09 21:57:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是单酶切还是双酶切？单酶切的话载体最好用磷酸酶处理去5'P，避免载体自连。如果是双酶切，确定两个酶的用量，是否都切割完全。既然是从胶上回收的，应该不会把没有切动的质粒回收下来的，可能是有一个酶作用不完全。做酶切的载体质粒和带目的片段的质粒最好定量，可以使酶切更完全有效，也可以避免酶过多产生星活性。
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6楼2013-01-10 07:18:55
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普通回帖

hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。
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2楼2013-01-09 20:03:55
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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。
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3楼2013-01-09 20:38:45
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hubohuna

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的，质粒最好切通宵，因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了，但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了，所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性，肯定是质粒没切充分。
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4楼2013-01-09 20:56:12
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用胶回收我就不谈酶切问题了，建议你做连接时，做几个不同的时间段，1,4,8，o/n. 再做转化，祝你好运！
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shine
7楼2013-01-10 10:57:24
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zhang881007

金虫 (小有名气)
忘了一点，质粒与插入片段比列也改变一下，减少质粒量试试。
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shine
8楼2013-01-10 10:58:39
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honey倩

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。...

我们实验室也是Fermentas的酶，但是还是用的传统的酶，快酶不咋好用呢…
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当你的眼泪忍不住要流出来的时候，睁大眼睛，千万别眨眼，你会看到世界由清晰到模糊的全过程~~
9楼2013-01-10 15:28:55
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前也遇到相同问题，转化率挺高，但没有阳性克隆，可以试试分步酶切，保证每个酶都起作用，保证双酶切
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10楼2013-01-10 17:14:52
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