24小时热门版块排行榜    

查看: 2672  |  回复: 15
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步:从测序成功的质粒上酶切出目的基因,凝胶回收。
第二步:把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点,凝胶回收。
第三部:用高效连接酶连接后转化DH5a
结果:转化效率很高,但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的,但是···为什么总是不对呢?
最近做的甚是苦逼,诸位大侠帮帮小弟吧。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是单酶切还是双酶切?单酶切的话载体最好用磷酸酶处理去5'P,避免载体自连。如果是双酶切,确定两个酶的用量,是否都切割完全。既然是从胶上回收的,应该不会把没有切动的质粒回收下来的,可能是有一个酶作用不完全。做酶切的载体质粒和带目的片段的质粒最好定量,可以使酶切更完全有效,也可以避免酶过多产生星活性。
6楼2013-01-10 07:18:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。
2楼2013-01-09 20:03:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。
3楼2013-01-09 20:38:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hubohuna

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的,质粒最好切通宵,因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了,但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了,所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性,肯定是质粒没切充分。
4楼2013-01-09 20:56:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 帮忙看看fileCode +3 wwncly 2026-08-10 5/250 2026-08-10 19:06 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 8月时间戳变的,举个手。玩一下,释放压力 +11 archvillain 2026-08-04 13/650 2026-08-10 14:41 by seekfind
[基金申请] 好奇怪的filecode +4 布布和一二 2026-08-08 5/250 2026-08-10 14:20 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了,今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧,后缀研究没有意义,别浪费时间了,过好目前的每一天,不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 有没有H口的?有收到消息的吗? +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 纯娱乐,不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
信息提示
请填处理意见