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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步:从测序成功的质粒上酶切出目的基因,凝胶回收。
第二步:把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点,凝胶回收。
第三部:用高效连接酶连接后转化DH5a
结果:转化效率很高,但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的,但是···为什么总是不对呢?
最近做的甚是苦逼,诸位大侠帮帮小弟吧。
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用胶回收我就不谈酶切问题了,建议你做连接时,做几个不同的时间段,1,4,8,o/n. 再做转化,祝你好运!
shine
7楼2013-01-10 10:57:24
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hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。
2楼2013-01-09 20:03:55
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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。
3楼2013-01-09 20:38:45
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hubohuna

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的,质粒最好切通宵,因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了,但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了,所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性,肯定是质粒没切充分。
4楼2013-01-09 20:56:12
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