应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接
162/2返回列表上一页12
查看: 2336  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主如果条件允许最好用双酶切。单酶切的载体自连有点麻烦，如果一定要单酶切，用磷酸酶处理下其实也还好。
连接的时候控制一下比例，一般情况下片段和载体的摩尔比在3：1到6：1之间，我用T4连接酶时，是10微升的反应体系里加75ng载体，片段的体积要根据浓度和大小算。
另外，如果载体比较大，不建议切胶回收，感觉直接用PCR产物纯化一下用会比较好。
赞一下 回复此楼
11楼2013-01-11 11:06:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
出现菌落而没有阳性克隆的情况大部分是因为你的载体没有切开的原因造成的，建议你用慢酶切过夜，确保你的质粒完全切开才行。
赞一下 回复此楼
12楼2013-01-11 17:51:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、若是双酶切，那么两个酶在共同buffer中酶活性怎么样？若一高一低差异太大，酶切效果肯定不好；可以先一个酶切，乙醇沉降后再另一个酶切；
2、你酶切的量为多少？凝胶回收得损失很大的，最好同时平行多做几管酶切或增大酶切体系，最后回收为一管的时候含量会高些；
3、连接的体系及时间都是影响因素。我们一般是10ul的连接体系，大小片段加入量为1:3；一般都连接16h以上；
4、转化的时候用蓝白斑筛选可以减少假阳性
赞一下 回复此楼
13楼2013-01-12 12:59:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我都用的takara的酶，没必要通宵啊，两小时就行了，浪费时间的，不同时段也没必要，够个载体很简单的东东没必要那么烦的。单酶切的话载体酶切完加个CIAP37℃十分钟就行了。双酶切一般不会有多大问题吧，不过有时候双酶切也需要加个CIAP脱磷酸化一下的。
赞一下 回复此楼
14楼2013-01-12 16:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒35S-GFP-1300是双酶切还是单酶切？切下来的小片段是多长？电泳条带清楚吗？你这样的情况，八成是大质粒没有切动，所以转化后长的斑很多，缺没有你的目的条带。还有检查下你的感受态有没有问题。
赞一下 回复此楼
15楼2013-01-12 17:12:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhang881007 at 2013-01-10 10:58:39
忘了一点，质粒与插入片段比列也改变一下，减少质粒量试试。

你的建议很好，我在尝试。Thank you
赞一下 回复此楼
16楼2013-01-15 11:20:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天使1Q86之城 的主题更新
162/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭