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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接
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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步：从测序成功的质粒上酶切出目的基因，凝胶回收。
第二步：把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点，凝胶回收。
第三部：用高效连接酶连接后转化DH5a
结果：转化效率很高，但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的，但是···为什么总是不对呢？
最近做的甚是苦逼，诸位大侠帮帮小弟吧。
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1楼 2013-01-09 19:54:41
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主如果条件允许最好用双酶切。单酶切的载体自连有点麻烦，如果一定要单酶切，用磷酸酶处理下其实也还好。
连接的时候控制一下比例，一般情况下片段和载体的摩尔比在3：1到6：1之间，我用T4连接酶时，是10微升的反应体系里加75ng载体，片段的体积要根据浓度和大小算。
另外，如果载体比较大，不建议切胶回收，感觉直接用PCR产物纯化一下用会比较好。
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11楼2013-01-11 11:06:51
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hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。
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2楼2013-01-09 20:03:55
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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够，有很多载体没切开，建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。
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3楼2013-01-09 20:38:45
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hubohuna

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶，一般四十分钟酶切就很充分了，切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的，质粒最好切通宵，因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了，但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了，所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性，肯定是质粒没切充分。
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4楼2013-01-09 20:56:12
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