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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切连接

第一步:从测序成功的质粒上酶切出目的基因,凝胶回收。
第二步:把质粒35S-GFP-1300酶切出同样的酶切位点,凝胶回收。
第三部:用高效连接酶连接后转化DH5a
结果:转化效率很高,但是没有阳性克隆。
正常来说只要是阳性克隆就应该没有问题的,但是···为什么总是不对呢?
最近做的甚是苦逼,诸位大侠帮帮小弟吧。
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
出现菌落而没有阳性克隆的情况大部分是因为你的载体没有切开的原因造成的,建议你用慢酶切过夜,确保你的质粒完全切开才行。
12楼2013-01-11 17:51:27
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hubohuna

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。
2楼2013-01-09 20:03:55
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天使1Q86之城

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hubohuna at 2013-01-09 20:03:55
你的应该是酶切时间不够,有很多载体没切开,建议酶切通宵。

我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。
3楼2013-01-09 20:38:45
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hubohuna

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
amisking: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-09 21:09:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天使1Q86之城 at 2013-01-09 20:38:45
我用的Fermetas快速内切酶,一般四十分钟酶切就很充分了,切质粒用了3个小时。...

快酶没有慢酶好用的,质粒最好切通宵,因为前面40分钟可能把90%的质粒切开了,但是要100%的切开所有质粒就必须切比较久了,所有最好切通宵。你说你的板子上长了很多的假阳性,肯定是质粒没切充分。
4楼2013-01-09 20:56:12
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