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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 求助 蛋白表达

本人用的全式金的pEASY-E1表达载体连接我的目的片段，经测序后，提质粒转化bl21诱导表达，37度，4h，但是，空载体，未诱导，以及诱导组在我的目的大小都有比较亮的条带，做his纯化，带很暗，该怎么办啊，求高手指教
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1楼 2012-12-29 10:33:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然有时候未诱导就能有表达，但最好确定是否是目的蛋白，做个Western鉴定一下。此外，优化诱导条件吧，温度、时间、浓度。
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2楼2012-12-29 11:12:46
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
空载体及未诱导均有条带，说明该很亮的条带中有一部分是菌体自身的蛋白，只是和你的目的蛋白重合而已；His纯化条带暗说明其实你的目的蛋白表达量很低，甚至有可能是杂蛋白。所以建议从摸索表达条件开始，楼主用的载体我未用过，但是应该差不多，可以适当提高诱导温度试试，比如说18度等。如果有条件，可以拿诱导表达后的菌体做一个目的蛋白特异性的western（非His特异性抗体）检测一下看看。
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3楼2012-12-29 15:43:06
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