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油菜DNA提取问题，用的CTAB法提取，要求质量高点
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| 如题，dna用来做snp，是用液氮磨样还是用打样机打样提的质量好，有经验的告诉一下 |
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xy656691
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2楼2012-12-11 14:49:55
【答案】应助回帖
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基因组DNA提取 试剂与溶液 (1)2%CTAB抽提缓冲溶液：CTAB4g，NaCl16.364g，先用70mLddH2O溶解，再加入1mol/L Tris-HCl(pH8.0)20mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)8mL，定容至200mL。灭菌，冷却后加入0.2%-1%琉基乙醇400μL。 (2)氯仿︰异戊醇=24︰1(V/V)：先加96mL氯仿，再加4mL异戊醇，摇匀。 (3)0.5mol/LEDTA(pH8.0)：186.21gNa2EDTA•2H2O溶于750mLddH2O，加入2mol/LNaOH至pH8.0，用ddH2O定容至1000mL。 (4)1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：121g Tris碱溶于750mLddH2O，加浓HCl至pH8.0，ddH2O定容至1000mL。 (5)TE缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH8.0)5mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL，ddH2O定容至500mL。 (6)10mg/mL RNase A(-20℃保存)：1mol/LTris-HCl(pH8.0)10μL，0.5mol/LNaCl30μL，RNase A10mg，ddH2O定容至1mL。 (7)75%乙醇：取无水乙醇375mL，加ddH2O至500mL。 (8)异丙醇 (7)、(8)使用前冷藏1-2小时。 方法与步骤 (1)将油菜自交系的种子在实验室内进行暗培养，待长至一定高度时，取幼嫩叶片作为提取DNA的材料。 (2)将2%CTAB提取液放入65℃水浴中预热5分钟。 (3)称取0.3-0.5g幼嫩叶片，放入研钵，加液氮后迅速研磨成粉末状。 (4)将叶片粉末迅速、小心地刮入2mL离心管中，加入1.0mL 65℃预热的2%CTAB提取液，颠倒混匀。 (5)将离心管放入65℃水浴中，保温40分钟，其间轻摇几次。 (6)取出离心管，在室温下放置1-2分钟，加入氯仿︰异戊醇(24︰1)至满管，上下颠倒摇晃2-3min，待两者混合均匀，以12000r/min的速度离心6min。 (7)移液器吸取上清至1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒摇匀约30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物。 (8)以12000r/min离心5min，倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立与铺开的纸巾上。 (9)60s后，直立离心管，用75%的乙醇洗2-3次，置于超净工作台风干(1-2h即可，若过分干燥，DNA沉淀会较难溶解)。 (10)加入50μL含RNase A(浓度10µg/mL)的TE缓冲液，37℃保温1-2小时，-20℃冷藏备用；在0.8%琼脂糖凝胶电泳上检查DNA完整性。 (11)利用分光光度计检测DNA的浓度及纯度，并稀释至60ng/µL备用。 |
3楼2012-12-12 20:41:44
lanqingkuo
木虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 2610.1
- 散金: 20
- 红花: 1
- 帖子: 242
- 在线: 72.5小时
- 虫号: 1338757
- 注册: 2011-07-06
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
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预处理样品中加入800 µL裂解缓冲液、10 µL蛋白酶K（20 mg/ml）和5 µL RNA酶（10 mg/ml），振荡混匀，于65℃水浴60-90 min；16000 g离心10 min； 取上清，加500 µL氯仿异戊醇，颠倒混匀30 s；16000 g离心10 min；取上清，加500 µL氯仿异戊醇，颠倒混匀30 s；16000 g离心5 min； 取上清，加2倍体积的沉淀缓冲液，颠倒混匀，室温放置60 min；16000 g离心10 min；弃上清，加350 µLNaCl溶液回溶；加500 µL氯仿异戊醇，颠倒混匀30 s；16000 g离心10 min； 取上清，加0.6倍体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，于-20 ℃放置30 min；16000 g离心10 min；弃上清，加500 µL 70%乙醇溶液，颠倒混匀清洗沉淀；16000 g离心10 min；弃上清，室温下风干后使用40 µL水回溶沉淀。 |
4楼2012-12-13 20:15:47
