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purple~sky铜虫 (小有名气)
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[求助]
第一次提DNA，急求方法：油菜DNA，用于PCR~~谢各位大侠
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| 各位高手大侠们，小女子由于跨专业，所以很多基础实验都不甚明了，现做实验需要从油菜中提取DNA，希望可以得到各位的指点和帮助…… |
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【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+2): 欢迎常来本版啊，呵呵 2012-02-29 10:04:29
小丹木木(金币+2): 欢迎常来本版啊，呵呵 2012-02-29 10:04:29
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油菜估计不算难提的植物吧？虽然提过很多植物，由于没法采到一直没机会呢。 鉴于你是第一次提，就自己配点试剂手提法练练手看是一个什么结果。 一般流程： 1、样品裂解 液氮研磨油菜成粉末状，然后转移至含裂解液（含RNase）离心管中，充分混匀。65度水浴30-60min，期间混匀数次。 2、除杂 加酚/氯仿抽提去除杂质。离心取上清。 3、沉淀 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA。离心沉淀下来用70%乙醇洗涤两次干燥后加入TE溶解即可。 ps:裂解液一般百度或查一下文献即有，可以尝试CTAB的。 以上方法有毒，如果经费允许也可以直接买个试剂盒提。简单省事，但学到的东西肯定不如自己手提。 |
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purple~sky
2楼2012-02-29 09:50:04
purple~sky
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3楼2012-02-29 09:57:54
【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+3, 专家考核): 热心应助，加入专家考核！ 2012-02-29 13:53:34
purple~sky: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-01 19:53:50
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purple~sky: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-01 19:53:50
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新鲜的油菜： 小提：研磨你可以多研一些，转移粉末可以用100mg，加入600-700ul左右裂解液。（我的做法是：使用2ml离心管，加入600ul裂解液后放置于电子天平上，然后用小药勺小心拨取样品于管内。不用很精确，约100mg即可） 水浴裂解后可以稍为离心一下去除渣子，取上清后加入等体积的酚氯仿抽提，然后离心取上清，再加入等体积的异丙醇。 ps：你用来做PCR的话小提应该也够了，油菜也不像DNA产量少的样品，100mg应该可以提个10来ug的DNA |
4楼2012-02-29 10:09:58
【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+2): 很热心哦，欢迎常来本版 2012-03-01 17:07:56
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我们实验室这边提的的是油菜种子的基因组DNA，你如果提油菜叶子的也可以。我们用的方法是CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法。试验流程你可以参考分子生物学相关书籍或百度搜索，以下你可以参考： ①称取干燥新鲜叶片约0.4 g置于干净的研钵中，剪成小片，加液氮充分研磨，至粉末呈浅灰绿色即可。 ②将磨碎的粉末等量分装于4个1.5 mL的微量离心管中，各加1 mL预热（约50 ℃）的2×CTAB缓冲液[含2% CTAB（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，Sigma），1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0.2%β-巯基乙醇（V/M）]，充分摇匀。 ③60 ℃保温1.5 h（如果时间不允许的话，可以适当缩短），每隔15 min～20 min摇匀一次。然后室温放置30 min，其间摇动1～2次。 ④10 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加酚-氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。 ⑤10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。 ⑥10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液。先加1/10体积预冷（4 ℃）的3 mol/L NaAc，再加预冷（4 ℃）的异丙醇至新管，将离心管轻轻翻转几次（约5 s），-20 ℃放置2 h以上或过夜。 ⑦10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50 μL 1×TE溶液溶解。 ⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA，30 ℃水浴或室温1 h去除RNA，置-20 ℃保存备用。 电泳检测：取5 μL DNA加1 μL上样缓冲液，于1%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/μL EB）中电泳检测. 建议：如果你之前没做过分子实验的话，最好还是找个师兄师姐带着你做。提前把试剂配制出来。或者买现成的植物基因组DNA提取试剂盒。 |
5楼2012-03-01 14:01:32
purple~sky
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6楼2012-03-01 14:25:54
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7楼2012-03-01 20:50:41
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8楼2012-03-27 10:58:28
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