| 查看: 1578 | 回复: 8 | ||
purple~sky铜虫 (小有名气)
|
[求助]
第一次提DNA，急求方法：油菜DNA，用于PCR~~谢各位大侠
|
| 各位高手大侠们，小女子由于跨专业，所以很多基础实验都不甚明了，现做实验需要从油菜中提取DNA，希望可以得到各位的指点和帮助…… |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有50人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 欢迎常来本版啊，呵呵 2012-02-29 10:04:29
小丹木木(金币+2): 欢迎常来本版啊，呵呵 2012-02-29 10:04:29
|
油菜估计不算难提的植物吧？虽然提过很多植物，由于没法采到一直没机会呢。 鉴于你是第一次提，就自己配点试剂手提法练练手看是一个什么结果。 一般流程： 1、样品裂解 液氮研磨油菜成粉末状，然后转移至含裂解液（含RNase）离心管中，充分混匀。65度水浴30-60min，期间混匀数次。 2、除杂 加酚/氯仿抽提去除杂质。离心取上清。 3、沉淀 加入乙醇或异丙醇沉淀DNA。离心沉淀下来用70%乙醇洗涤两次干燥后加入TE溶解即可。 ps:裂解液一般百度或查一下文献即有，可以尝试CTAB的。 以上方法有毒，如果经费允许也可以直接买个试剂盒提。简单省事，但学到的东西肯定不如自己手提。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
purple~sky
2楼2012-02-29 09:50:04
purple~sky
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 371.8
- 帖子: 63
- 在线: 33小时
- 虫号: 1032637
- 注册: 2010-05-31
- 性别: MM
- 专业: 作物分子育种
3楼2012-02-29 09:57:54
【答案】应助回帖
★
wanhscn(金币+3, 专家考核): 热心应助，加入专家考核！ 2012-02-29 13:53:34
purple~sky: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-01 19:53:50
wanhscn(金币+3, 专家考核): 热心应助，加入专家考核！ 2012-02-29 13:53:34
purple~sky: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-04-01 19:53:50
|
新鲜的油菜： 小提：研磨你可以多研一些，转移粉末可以用100mg，加入600-700ul左右裂解液。（我的做法是：使用2ml离心管，加入600ul裂解液后放置于电子天平上，然后用小药勺小心拨取样品于管内。不用很精确，约100mg即可） 水浴裂解后可以稍为离心一下去除渣子，取上清后加入等体积的酚氯仿抽提，然后离心取上清，再加入等体积的异丙醇。 ps：你用来做PCR的话小提应该也够了，油菜也不像DNA产量少的样品，100mg应该可以提个10来ug的DNA |
4楼2012-02-29 10:09:58
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 很热心哦，欢迎常来本版 2012-03-01 17:07:56
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 很热心哦，欢迎常来本版 2012-03-01 17:07:56
|
我们实验室这边提的的是油菜种子的基因组DNA，你如果提油菜叶子的也可以。我们用的方法是CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法。试验流程你可以参考分子生物学相关书籍或百度搜索，以下你可以参考： ①称取干燥新鲜叶片约0.4 g置于干净的研钵中，剪成小片，加液氮充分研磨，至粉末呈浅灰绿色即可。 ②将磨碎的粉末等量分装于4个1.5 mL的微量离心管中，各加1 mL预热（约50 ℃）的2×CTAB缓冲液[含2% CTAB（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，Sigma），1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0.2%β-巯基乙醇（V/M）]，充分摇匀。 ③60 ℃保温1.5 h（如果时间不允许的话，可以适当缩短），每隔15 min～20 min摇匀一次。然后室温放置30 min，其间摇动1～2次。 ④10 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加酚-氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。 ⑤10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。 ⑥10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液。先加1/10体积预冷（4 ℃）的3 mol/L NaAc，再加预冷（4 ℃）的异丙醇至新管，将离心管轻轻翻转几次（约5 s），-20 ℃放置2 h以上或过夜。 ⑦10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50 μL 1×TE溶液溶解。 ⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA，30 ℃水浴或室温1 h去除RNA，置-20 ℃保存备用。 电泳检测：取5 μL DNA加1 μL上样缓冲液，于1%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/μL EB）中电泳检测. 建议：如果你之前没做过分子实验的话，最好还是找个师兄师姐带着你做。提前把试剂配制出来。或者买现成的植物基因组DNA提取试剂盒。 |
5楼2012-03-01 14:01:32
purple~sky
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 371.8
- 帖子: 63
- 在线: 33小时
- 虫号: 1032637
- 注册: 2010-05-31
- 性别: MM
- 专业: 作物分子育种
6楼2012-03-01 14:25:54
yixinyuan
木虫 (正式写手)
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 6174.1
- 散金: 7
- 红花: 3
- 帖子: 558
- 在线: 162.7小时
- 虫号: 1151599
- 注册: 2010-11-20
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2012-03-01 20:50:41
紫色流星1
金虫 (初入文坛)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1116.3
- 散金: 20
- 帖子: 44
- 在线: 15.7小时
- 虫号: 1716730
- 注册: 2012-03-26
- 性别: MM
- 专业: 污染生态学
8楼2012-03-27 10:58:28
purple~sky
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 371.8
- 帖子: 63
- 在线: 33小时
- 虫号: 1032637
- 注册: 2010-05-31
- 性别: MM
- 专业: 作物分子育种
9楼2012-03-27 13:56:12
