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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] pcr实验相关

我想从青霉里面克隆菊粉酶基因，之前退火在42度的时候做出来过，但是觉得条带浅没有回收，但是不知道为什么后来重复了几百组实验都没有在做出来过。引物的Tm值是51.65，我从40到60度来来回回的试了很多遍了。为什么会做不出来了呢？麻烦大家江湖急救一下，给的指导吧。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-11-28 22:35:18
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
2楼2012-11-29 00:23:34
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再就是增加循环数，用好的酶
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3楼2012-11-29 05:06:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种情况，果断重新设计引物。类似情况多次发生在我们实验室，引物不够特异或质量不好很容易造成这种情况
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4楼2012-11-29 08:54:21
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
别摸；了 ，就是引物不好使呗，重新设计引物
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很给力
5楼2012-11-29 11:09:33
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by catmihzh at 2012-11-29 00:23:34
可能是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr

我也怀疑引物被降解或污染了，所以我重新合成的引物，依旧没有做出来。我提的基因组浓度蛮高的，最近我又跑电泳试了一下，是有一点降解。我现在尝试稀释一百倍后的效果，不知道会怎样。我没有做过降落pcr，能不能麻烦你给我说一下降落pcr具体步骤，麻烦你了。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
6楼2012-11-29 17:57:04
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bloodwar at 2012-11-29 05:06:16
再就是增加循环数，用好的酶

我用的takara的酶，应该还过去的吧？！我现在没有p出条带来，增加循环会好使吗？
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有今生没来世，且行且珍惜。
7楼2012-11-29 17:59:15
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:54:21
这种情况，果断重新设计引物。类似情况多次发生在我们实验室，引物不够特异或质量不好很容易造成这种情况

我也怀疑是引物问题。但是我是从一个罕见的青霉中克隆基因的，目前都没有对这种青霉官方命名，更没有确定的序列，是通过筛选和测酶活确定产酶的。这种情况下设计引物，几乎等于从未知序列中提取未知基因，师兄从基因库里找的的青霉属的菊粉酶基因设计的一对引物，计划p出1500左右的片段。好有压力啊。。。。
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有今生没来世，且行且珍惜。
8楼2012-11-29 18:06:47
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunlk at 2012-11-29 11:09:33
别摸；了 ，就是引物不好使呗，重新设计引物

我是从一个罕见的青霉中克隆基因的，目前都没有对这种青霉官方命名，更没有确定的序列，是通过筛选和测酶活确定产酶的。这种情况下设计引物，几乎等于从未知序列中提取未知基因，有什么好的建议吗？
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有今生没来世，且行且珍惜。
9楼2012-11-29 18:09:41
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sunlk

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 18:09:41
我是从一个罕见的青霉中克隆基因的，目前都没有对这种青霉官方命名，更没有确定的序列，是通过筛选和测酶活确定产酶的。这种情况下设计引物，几乎等于从未知序列中提取未知基因，有什么好的建议吗？...

blast搜索下，看看有没有同源序列
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很给力
10楼2012-11-29 19:30:02
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