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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 17:57:04
我也怀疑引物被降解或污染了，所以我重新合成的引物，依旧没有做出来。我提的基因组浓度蛮高的，最近我又跑电泳试了一下，是有一点降解。我现在尝试稀释一百倍后的效果，不知道会怎样。我没有做过降落pcr，能不能麻 ...

降落pcr分为两个部分进行，主要在退火温度上做功夫，第一部分退火初始温度设高点，比如65度，每个循环降1度，设20个循环。第二部分退火温度设低，比如46度，进行15-20个循环。其他变性延伸之类的跟普通pcr一样

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
11楼2012-11-30 00:31:35
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换掉所有试剂试一下，如果还不行的话，重新设计引物吧
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12楼2012-11-30 14:03:53
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 18:06:47
我也怀疑是引物问题。但是我是从一个罕见的青霉中克隆基因的，目前都没有对这种青霉官方命名，更没有确定的序列，是通过筛选和测酶活确定产酶的。这种情况下设计引物，几乎等于从未知序列中提取未知基因，师兄从基 ...

既然可以一对，那么设计其他引物肯定也是可以的。跟你师兄要一下原始序列重新设计就可以了
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13楼2012-11-30 14:12:36
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xiefl1984

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意二楼应该是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr
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14楼2012-11-30 16:43:07
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sunlk at 2012-11-29 19:30:02
blast搜索下，看看有没有同源序列...

同一个属同源系列很少，可能目前对其研究还不是很深入。该基因资源在genebank中序列很少，几乎可以说是就一个，所以引物构建的时候貌似很单一很特异。但是实验操作起来就费劲了，p不出来，引物方面几乎不知道怎么更换。
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有今生没来世，且行且珍惜。
15楼2012-12-04 12:18:01
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by catmihzh at 2012-11-30 00:31:35
降落pcr分为两个部分进行，主要在退火温度上做功夫，第一部分退火初始温度设高点，比如65度，每个循环降1度，设20个循环。第二部分退火温度设低，比如46度，进行15-20个循环。其他变性延伸之类的跟普通pcr一样
...

降落的部分是不是意味着程序以列表的形式设置？最后在46度的地方设计循环15-20个？另外请教一下，我的基因在1500bp左右的话，延伸时间用多久最好？谢谢啦，嘿嘿
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16楼2012-12-04 12:21:32
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-30 14:03:53
换掉所有试剂试一下，如果还不行的话，重新设计引物吧

在基因库中我这个基因资源很少，引物几乎处于没得换的状态，我换试剂试试。谢谢啦
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17楼2012-12-04 12:23:25
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by chenguestc at 2012-11-30 14:12:36
既然可以一对，那么设计其他引物肯定也是可以的。跟你师兄要一下原始序列重新设计就可以了...

原始序列已经拿到了，就是从起始密码到终止密码的序列，单从序列看他引物设计没有问题，基因库中该属的基因就两个，一个是前体一个是基因，他是根据基因的序列设计的。我想知道前体和基因什么差别，是不是能按照前体的序列设计引物试试，我想确认可能性很大才行，不然和老板不好交代啊。。。谢谢哈
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18楼2012-12-04 12:28:41
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Cllair

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiefl1984 at 2012-11-30 16:43:07
同意二楼应该是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr

模板有少许降解问题，从基因组一提出来跑胶验证的时候就是类似降解的情况，请问这个和试剂盒有关系吗，我是用试剂盒提取的，基因组在一万多个碱基左右。
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19楼2012-12-04 12:32:19
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by Cllair at 2012-12-04 12:28:41
原始序列已经拿到了，就是从起始密码到终止密码的序列，单从序列看他引物设计没有问题，基因库中该属的基因就两个，一个是前体一个是基因，他是根据基因的序列设计的。我想知道前体和基因什么差别，是不是能按照前 ...

前体只是没有经过修饰的。既然两个序列都有，为什么不比对下用保守区设计呢？
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20楼2012-12-05 08:28:57
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