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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr实验相关
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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] pcr实验相关

我想从青霉里面克隆菊粉酶基因，之前退火在42度的时候做出来过，但是觉得条带浅没有回收，但是不知道为什么后来重复了几百组实验都没有在做出来过。引物的Tm值是51.65，我从40到60度来来回回的试了很多遍了。为什么会做不出来了呢？麻烦大家江湖急救一下，给的指导吧。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-11-28 22:35:18
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 17:57:04
我也怀疑引物被降解或污染了，所以我重新合成的引物，依旧没有做出来。我提的基因组浓度蛮高的，最近我又跑电泳试了一下，是有一点降解。我现在尝试稀释一百倍后的效果，不知道会怎样。我没有做过降落pcr，能不能麻 ...

降落pcr分为两个部分进行，主要在退火温度上做功夫，第一部分退火初始温度设高点，比如65度，每个循环降1度，设20个循环。第二部分退火温度设低，比如46度，进行15-20个循环。其他变性延伸之类的跟普通pcr一样

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
11楼2012-11-30 00:31:35
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
2楼2012-11-29 00:23:34
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再就是增加循环数，用好的酶
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3楼2012-11-29 05:06:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种情况，果断重新设计引物。类似情况多次发生在我们实验室，引物不够特异或质量不好很容易造成这种情况
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4楼2012-11-29 08:54:21
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