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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Cllair

金虫 (小有名气)

[求助] pcr实验相关

我想从青霉里面克隆菊粉酶基因，之前退火在42度的时候做出来过，但是觉得条带浅没有回收，但是不知道为什么后来重复了几百组实验都没有在做出来过。引物的Tm值是51.65，我从40到60度来来回回的试了很多遍了。为什么会做不出来了呢？麻烦大家江湖急救一下，给的指导吧。
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有今生没来世，且行且珍惜。
1楼 2012-11-28 22:35:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 18:06:47
我也怀疑是引物问题。但是我是从一个罕见的青霉中克隆基因的，目前都没有对这种青霉官方命名，更没有确定的序列，是通过筛选和测酶活确定产酶的。这种情况下设计引物，几乎等于从未知序列中提取未知基因，师兄从基 ...

既然可以一对，那么设计其他引物肯定也是可以的。跟你师兄要一下原始序列重新设计就可以了
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13楼2012-11-30 14:12:36
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是模板问题，不纯或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制备模板和稀释引物后还p不出来，建议尝试降落pcr

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
2楼2012-11-29 00:23:34
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再就是增加循环数，用好的酶
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3楼2012-11-29 05:06:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种情况，果断重新设计引物。类似情况多次发生在我们实验室，引物不够特异或质量不好很容易造成这种情况
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4楼2012-11-29 08:54:21
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