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zhougzhou

至尊木虫 (正式写手)

[求助] GFP重组表达质粒电泳问题

我构建的GFP与一个基因的重组表达载体,正常下应该是5kbp左右,但每次提质粒后电泳都显示在2500bp左右有条强带,而5kbp左右也有条带但较弱。请问这是正常的吗?急求答案。
PS:小弟接着下去要做转染,以前做成功过(能发绿色荧光),但最近怎么不发光了,所以想问是否构建质粒出了问题。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
所提质粒可能会有三种构象:超螺旋、开环、线性。质粒提得好的话,基本上都是超螺旋构象的,在胶中跑得比线性分子快很多。如果提质粒比较粗暴,可能会看到的开环和线性的条带。marker的条带是线性分子。如果想确定质粒的分子量,需要做一个简单的单酶切,把质粒切成线性分子后再和marker比就可以了。
3楼2012-11-29 07:51:50
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhougzhou: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-30 03:39:49
没做酶切的质粒电泳是不能判断质粒大小的,无论是跑快了还是跑慢了,过去我认为质粒会有两条带,超螺旋构象的,和松弛构象的,但做的多了就知道了,5K的质粒跑出10k的大小都可能正常,酶切后如果大小不对,那就有问题了,为此我打过几个质粒提取试剂盒的技术支持的电话,也测序验证过一些。不要尽相信分子克隆上的话。
2楼2012-11-28 19:16:36
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