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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » GFP重组表达质粒电泳问题
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zhougzhou

至尊木虫 (正式写手)

[求助] GFP重组表达质粒电泳问题

我构建的GFP与一个基因的重组表达载体，正常下应该是5kbp左右，但每次提质粒后电泳都显示在2500bp左右有条强带，而5kbp左右也有条带但较弱。请问这是正常的吗？急求答案。
PS：小弟接着下去要做转染，以前做成功过（能发绿色荧光），但最近怎么不发光了，所以想问是否构建质粒出了问题。
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1楼 2012-11-28 09:07:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
所提质粒可能会有三种构象：超螺旋、开环、线性。质粒提得好的话，基本上都是超螺旋构象的，在胶中跑得比线性分子快很多。如果提质粒比较粗暴，可能会看到的开环和线性的条带。marker的条带是线性分子。如果想确定质粒的分子量，需要做一个简单的单酶切，把质粒切成线性分子后再和marker比就可以了。
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3楼2012-11-29 07:51:50
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhougzhou: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-30 03:39:49
没做酶切的质粒电泳是不能判断质粒大小的，无论是跑快了还是跑慢了，过去我认为质粒会有两条带，超螺旋构象的，和松弛构象的，但做的多了就知道了，5K的质粒跑出10k的大小都可能正常，酶切后如果大小不对，那就有问题了，为此我打过几个质粒提取试剂盒的技术支持的电话，也测序验证过一些。不要尽相信分子克隆上的话。
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2楼2012-11-28 19:16:36
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