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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于酶切问题
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 关于酶切问题

今天做了个酶切  但不知道为什么会出现目的片段紧贴着两条带 不知道是切得时间过长还是酶切好？早上11点开始切切到下午7点
图中特别亮的为目的带  marker旁边是pET30b 然后是pET28a  
用Xho1和BamH1切的  载体本身是5369bp 两个酶切位点切去的是40bp

11.22酶切pET28a, pET30b.JPG_副本.jpg
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1楼 2012-11-22 21:51:42
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要是有空白对照就好了，就是没有被切的质粒。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-11-22 23:44:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是有酶切不完全的质粒在里面，2L说的有道理，跑下质粒对照比较好。
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3楼2012-11-23 04:32:34
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1514132

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是酶切不完全或者过头都有可能，跑一下空白对照啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2012-11-23 06:37:16
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-22 23:44:37
要是有空白对照就好了，就是没有被切的质粒。

这是提出来的质粒28a   点了6微升的样

11.22质粒pET28a_副本.jpg
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5楼2012-11-23 08:42:05
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-11-23 08:42:05
这是提出来的质粒28a   点了6微升的样

11.22质粒pET28a_副本.jpg
...

这个电泳染色时间有点儿短，条带分不清，建议再跑一次，酶切前后在一块胶上跑。同时跑电泳的时间也长一些。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2012-11-23 09:06:13
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-23 09:06:13
这个电泳染色时间有点儿短，条带分不清，建议再跑一次，酶切前后在一块胶上跑。同时跑电泳的时间也长一些。
...

哎  说来话长 我本来跑的胶挺好的 结果是在我们同学那照的照片，没给我保存就直接给删了  还得我把东西都扔了之后才发现没有保存  后来把碎的胶捡了回来重新照的
我买了新的内切酶  等厂家给送来之后 再重新做  到时候会按您说的这样跑胶看情况的
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7楼2012-11-23 09:23:44
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑个质粒对照，时间应该没事，让胶跑时间长些，反正你的目的条带比较大，这样看的更清楚些
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8楼2012-11-23 09:43:04
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2012-11-23 09:23:44
哎  说来话长 我本来跑的胶挺好的 结果是在我们同学那照的照片，没给我保存就直接给删了  还得我把东西都扔了之后才发现没有保存  后来把碎的胶捡了回来重新照的
我买了新的内切酶  等厂家给送来之后 再重新做   ...

不用客气 祝你实验顺利！
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9楼2012-11-23 11:22:32
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
怎么没看到切下来40bp的片段？你用的那家的酶？酶切时间过长会有星效应的
还有，单纯跑质粒不能作为对照，因为环状质粒比线性片段迁移的速率更快，可以用质粒单酶切做对照
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
10楼2012-11-23 20:34:05
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