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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切的问题
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Millgary

银虫 (小有名气)

[交流] 双酶切的问题 已有7人参与

我最近做双酶切，用的NEB的Sac 2和Hind 3，但是酶切10，20min,1h都没有任何条带，我最后做了质粒只加buffer的，37度20分钟后也没有条带了，我换用宝生物的Hind 3的Mbuffer，37度20分钟后也没有条带了，但是不加buffer的质粒37度20分钟后再电泳还有条带，这是怎么回事呢，以前有人碰到过这样的问题吗。
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1楼 2012-11-20 11:25:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是质粒的条带没有，还是目的条带没有？
看下酶量有没有过多，或者质粒本身质量不够好的时候会出现这种情况。也曾试过是由于酶效率降低或失活或导致酶切后跑胶发现全部都拖尾降解。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
2楼2012-11-20 11:28:28
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dengyuanbao

木虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你做的是50的体系吗？还有大约1UL的酶可以酶切5-6Ul的质粒，你50 体系的话加2.5UL的酶，然后把ddH2O 换了，用新灭菌的水试试
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7楼2012-11-20 15:44:54
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晴晴618

铁虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by Millgary at 2012-11-20 16:32:45
酶切之后什么条带都没有了，不知道怎么回事。...

没有被没切的质粒也跑个样看看
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12楼2012-11-20 17:00:58
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天空2011

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by Millgary at 2012-11-20 11:31:54
我现在的问题是，5μl质粒+5μlbuffer，37度温育20分钟后，跑电泳就看不到任何条带了，但是5μl质粒37度温育20分钟后，跑电泳还有，这个弄的我特头疼。...

照个情况看，应该是你buffer有问题，将质粒给降解了
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13楼2012-11-20 20:44:32
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普通回帖

Millgary

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-20 11:28:28
是质粒的条带没有，还是目的条带没有？
看下酶量有没有过多，或者质粒本身质量不够好的时候会出现这种情况。也曾试过是由于酶效率降低或失活或导致酶切后跑胶发现全部都拖尾降解。

我现在的问题是，5μl质粒+5μlbuffer，37度温育20分钟后，跑电泳就看不到任何条带了，但是5μl质粒37度温育20分钟后，跑电泳还有，这个弄的我特头疼。
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3楼2012-11-20 11:31:54
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
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换一管buffer试试
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4楼2012-11-20 11:39:30
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Millgary

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-20 11:39:30
换一管buffer试试

随酶给了两管Buffer,我都做了一下，还是不行。
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5楼2012-11-20 11:42:16
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by Millgary at 2012-11-20 11:31:54
我现在的问题是，5μl质粒+5μlbuffer，37度温育20分钟后，跑电泳就看不到任何条带了，但是5μl质粒37度温育20分钟后，跑电泳还有，这个弄的我特头疼。...

说明你质粒被降解了，你用的东西，可能有个别试剂污染了核酸酶了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2012-11-20 12:31:02
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晴晴618

铁虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本身被酶切的质粒有条带没？
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8楼2012-11-20 16:25:58
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Millgary

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 晴晴618 at 2012-11-20 16:25:58
本身被酶切的质粒有条带没？

酶切之后什么条带都没有了，不知道怎么回事。
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9楼2012-11-20 16:32:45
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wxlzzzz

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-20 12:31:02
说明你质粒被降解了，你用的东西，可能有个别试剂污染了核酸酶了...

建议提取质粒最后的洗脱用灭菌水不要用试剂盒的TE，还有洗脱的灭菌水最好要合格，不要被污染。如果有细菌，肯定就有核酸酶。从对比试验看，楼主多注意质粒本身问题。
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Millgary
你做了什么，什么都没做。
10楼2012-11-20 16:38:56
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