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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR跑胶成这样。。。请各位大侠帮我看看，坐等回复。。
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ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] PCR跑胶成这样。。。请各位大侠帮我看看，坐等回复。。

做基因克隆，目的片段1100bp，PCR体系25μl：DNTP  4μL,buffer 2.5μL,引物各 1μL，模版DNA 1μL(用试剂盒提的，浓度在50-80ng/μL），TAKARA LA taq  0.25 μL,ddH2O 15.25 μL。PCR反应程序为;94℃ 5min,94℃ 30s，65℃ 30s, 72℃ 1min,72℃ 7min,40个循环。1.2%的琼脂糖，100V，50min。2000的marker。切胶回收把所有的都加上了。之前扩得很顺利，这一阵不知道怎么回事，就是出不来了，有的话条带也很浅，拖尾十分严重。。以为是模版的问题，又重新提了DNA，把酶、引物还有缓冲液都换过一遍了，结果还是一样，，现在实验停滞不前了，望各位高手帮我分析分析找找解决办法。。。。。

1.png上面为DNA的编号，每个样本P了两管。



2.png



4.png之前跑的正常的图片
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1楼 2012-11-15 15:52:00
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回帖置顶 ( 共有3个 )

review

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★有帮助 2012-11-15 20:24:49
ym6104: 回帖置顶 2012-11-16 17:30:41
引物的问题   换个引物
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交流
4楼2012-11-15 16:28:37
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hourl11

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5 2012-11-16 10:47:47
ym6104: 回帖置顶 2012-11-16 17:29:10
ym6104: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-11-16 17:29:38
本帖内容被屏蔽

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ym6104
28楼2012-11-16 09:06:43
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ym6104

金虫 (小有名气)
ym6104: 回帖置顶 2012-11-17 12:24:20
引用回帖:
39楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-16 16:38:16
楼主问题解决没有呢？很想知道答案。。。...

问题解决啦，就是引物的问题，重新设计了一对引物，条带很亮，也没有拖尾。
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40楼2012-11-16 17:24:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-15 18:56:09
ym6104: 金币+5, ★有帮助 2012-11-15 20:24:31
以前也碰到p不出来的情况，后来用primer star 扩出来了，楼主的buffer用的是GC buffer I还是LA自带的那个buffer，我一般用前面那个GC的，效果还不错。还有就是循环数可以稍微减少点，你加的酶不是很多，到后面都不够了。祝好运
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ym6104
一花一世界、一叶一菩提
2楼2012-11-15 16:11:34
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q7111988

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+2 2012-11-16 10:44:29
电泳仪没出什么问题吧
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Life is a pure flame, and we live by an invisible sun within us.
23楼2012-11-15 21:33:43
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+2 2012-11-16 10:44:36
7-1那个一个胶，我看marker都不清晰，有没有考虑过胶配的不好，或者电泳条件不合适。
27 28 29 ，感觉有部分滞留在胶空，是不是上样太多。

PS：这种情况，你可以用实验室其他同学用的比较容易扩出来的模版引物做一次实验，如果也做不出来，才是使用的试剂出了问题。
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24楼2012-11-15 21:50:36
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普通回帖

ym6104

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2012-11-15 16:11:34
以前也碰到p不出来的情况，后来用primer star 扩出来了，楼主的buffer用的是GC buffer I还是LA自带的那个buffer，我一般用前面那个GC的，效果还不错。还有就是循环数可以稍微减少点，你加的酶不是很多，到后面都不够 ...

我用的是自带的buffer,加的东西是按他说明书上加的，之前这么做一直没什么问题，现在怎么都不行了。。。下次试试减少循环数吧。十分感谢
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3楼2012-11-15 16:24:09
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by review at 2012-11-15 16:28:37
引物的问题   换个引物

可是上个星期也是这个引物都扩出来了呀，这又是为什么呢？
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5楼2012-11-15 16:32:32
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+2, ★有帮助 2012-11-15 20:25:06
确定模板没问题的话，我想是不是引物出问题了，是不是引物降解了？
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6楼2012-11-15 16:45:39
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ym6104

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hlwnxfd2011 at 2012-11-15 16:45:39
确定模板没问题的话，我想是不是引物出问题了，是不是引物降解了？

开始也以为是引物污染或者讲解了，前两天就重新到公司合成了，所以应该不是引物讲解了。
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7楼2012-11-15 16:53:54
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+2 2012-11-15 20:25:23
不要忘记考虑你的仪器和设定的程序
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8楼2012-11-15 16:57:45
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meldoyren

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ym6104: 金币+5 2012-11-15 20:25:34
可以试着改变Mg2+浓度，或者可以尝试加入DMSO，但是缺点是非特异性增加，可能会出现点突变。供参考
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ym6104
9楼2012-11-15 17:04:42
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ym6104

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by meldoyren at 2012-11-15 17:04:42
可以试着改变Mg2+浓度，或者可以尝试加入DMSO，但是缺点是非特异性增加，可能会出现点突变。供参考

十分感谢
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10楼2012-11-15 18:30:52
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