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1楼2013-06-01 12:54:25

回帖置顶 ( 共有1个 )

德国工兵铲

金虫 (小有名气)

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gyesang: 回帖置顶 2013-06-03 10:48:38

1 marker跑的好，胶没有问题

2 产物拖尾严重，
首先可减少跑胶时加样量，
其次你引物的特异性不高，可做一个退火温度梯度。
再次PCR体系不一定非要按照说明书上来，可适当降低模板浓度，看看能不能提高特异性扩增。

9楼2013-06-03 10:29:22

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zhoulubin

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gyesang: 金币+5, 鼓励回帖应助！ 2013-06-01 14:58:32

多大浓度的胶，上样顺序，上样量，分别是什么样品，出的什么问题都没告诉，猜谜一样
还有，PCR的东西想要得到更准确的分析，还应告知PCR反应条件和体系
新手呀

每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道

2楼2013-06-01 14:39:58

824191848

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引用回帖:

2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-01 14:39:58
多大浓度的胶，上样顺序，上样量，分别是什么样品，出的什么问题都没告诉，猜谜一样
还有，PCR的东西想要得到更准确的分析，还应告知PCR反应条件和体系
新手呀

是啊。。。新手，胶浓度是1.5%的，上样量是6微升。从右边依次是marker，然后剩下四条带分别是用两种不同引物扩增自己用试剂盒提取的质粒的产物，第一条和第三条是同一种引物，第二条和第四条是同一种引物。感觉是不是拖尾有点严重。。而且从左边数的第二条带怎么会有那么亮的一条。。

PCR程序是：94度 5min
               94度 45s
               59度 45s
               72度 45s
               29循环
         72度 10min
反应体系应该问题不大吧，我按照PCR试剂盒的说明书的量加的
  试剂          终浓度             50 µl体系
Sterilized ddH2O       -                            20.8 µl
10×PCR Buffer       1×                            5 µl
dNTP Mix             0.2 mmol/L                   5 µl
Primer 1                1 µmol/L x                   5 µl
Primer 2                1 µmol/L x                   5 µl
Taq DNA Polymerase    1 U                      0.2 µl
MgCl2                   4 mmol/L                   8 µl
模板             10 pg-1 µg             1 µl
多谢啊！！

3楼2013-06-01 15:06:15

zhoulubin

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理论片段（预期片段）多大？
引物以前有做过有问题吗？

每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道

4楼2013-06-01 16:35:30

箫箫客

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-03 10:48:05

首先我感觉你的胶放倒了吧，有孔的应该在上边，更直观一些。其次拖带严重，可能是非特异性产物太多，可以适当提高退火温度，减少非特异性引物试试，祝好运

5楼2013-06-02 15:28:00

zhoutianhe

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我也刚开始做pcr，和做的差不多。。。

6楼2013-06-02 20:01:26

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 箫箫客 at 2013-06-02 15:28:00
首先我感觉你的胶放倒了吧，有孔的应该在上边，更直观一些。其次拖带严重，可能是非特异性产物太多，可以适当提高退火温度，减少非特异性引物试试，祝好运

我也这样放。。。

7楼2013-06-03 00:43:09

rxh19891220

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Marker跑的很好，我觉得胶应该没有什么问题，是不是PCR产物降解？还有可能就是引物设计不是很好，特异性不高；也可以提高退火温度再进行PCR试试

8楼2013-06-03 10:12:12

冷雁孤旅

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3楼: Originally posted by 824191848 at 2013-06-01 15:06:15
是啊。。。新手，胶浓度是1.5%的，上样量是6微升。从右边依次是marker，然后剩下四条带分别是用两种不同引物扩增自己用试剂盒提取的质粒的产物，第一条和第三条是同一种引物，第二条和第四条是同一种引物。感觉是 ...

退火 37-55就足够了

生命不息奋斗不止

10楼2013-06-03 11:08:00