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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真核质粒扩增
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petrel932562

铜虫 (小有名气)

[求助] 真核质粒扩增

这方面的完全新人一个，想问下让公司构建好真核表达载体后，我要自己扩增质粒，那放在大肠杆菌里扩增可以么？大肠杆菌不是原核生物门么？要是不可以的话，我该怎么扩增？急求~望大虫们能帮助下！
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1楼 2012-10-26 23:53:20
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diandong

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2012-10-27 11:10:57
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petrel932562

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by diandong at 2012-10-27 11:10:57
将真核上的片段酶切下来，换成原核的克隆载体或表达载体。

就是直接拿回来放在大肠杆菌里扩增不可以的啊？那就是还是要自己用原核的克隆载体导入到大肠杆菌里扩增好，酶切这个扩增了的质粒和真核表达载体，在把我要的这段基因和真核表达连接么？？？然后再去测序鉴定下？
要是我把拿回来的真核表达载体放到真菌里，是不是就是会表达多而克隆少？
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3楼2012-10-27 23:02:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
petrel932562: 金币+5, ★★★很有帮助, 可不可以在追问下有没有表达可以表达2种外源基因的穿梭质粒 2012-10-28 17:59:12
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-10-29 15:46:58
直接弄个穿梭质粒不就好了，既可以用真核的表达体系，又可以在大肠杆菌里扩增。
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4楼2012-10-28 04:16:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-28 04:16:20
直接弄个穿梭质粒不就好了，既可以用真核的表达体系，又可以在大肠杆菌里扩增。

你说表达两种外源基因是什么意思？是两个基因来源于不同物种，想一起表达在一个真核细胞里，还是说你想用不同的启动子分别表达？
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petrel932562
5楼2012-10-29 00:57:44
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petrel932562

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-29 00:57:44
你说表达两种外源基因是什么意思？是两个基因来源于不同物种，想一起表达在一个真核细胞里，还是说你想用不同的启动子分别表达？...

想在一个质粒里同时表达2种基因。。。一个成骨一个成血管，然后之前质粒选得是pIRES，然后很想问的是，这个质粒可不可以在原核的大肠杆菌里扩增。。。
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6楼2012-10-29 23:28:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:50:03
petrel932562: 金币+10, ★★★很有帮助, 这个质粒有ColE1 ori，f1 ori，SV40 ori。。。算齐全了么？是不是有真核和原核的2中启动子就可以实现我期望的同一个质粒在真核细胞里表达在原核细胞里克隆扩增啦？2个多克隆位点是在ColE1 ori和f1 ori（SV40 ori 紧接于f1 ori之后）的，方向是从ColE1 ori开始的。麻烦啦 2012-10-30 22:22:31
引用回帖:
6楼: Originally posted by petrel932562 at 2012-10-29 23:28:22
想在一个质粒里同时表达2种基因。。。一个成骨一个成血管，然后之前质粒选得是pIRES，然后很想问的是，这个质粒可不可以在原核的大肠杆菌里扩增。。。...

这个质粒我没用过。你查一下它是否含有细菌的复制起点。如果是真核表达穿梭质粒，应该有两个ori，一个是在真核宿主里复制用的，一个是在原核宿主里复制用的。
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7楼2012-10-30 08:28:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
petrel932562: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 太感谢你啦~ 2012-10-31 12:19:16
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-30 08:28:36
这个质粒我没用过。你查一下它是否含有细菌的复制起点。如果是真核表达穿梭质粒，应该有两个ori，一个是在真核宿主里复制用的，一个是在原核宿主里复制用的。...

ColE1 ori是细菌复制起点，f1 ori是噬菌体复制起点，SV40 ori好像是哺乳动物细胞的复制起点。复制起点的位置没什么太大关系，只要有就说明这个载体可以在相应的细胞内复制扩增。
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8楼2012-10-31 07:25:37
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