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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用CHO进行分泌表达

Sample Text    我想利用CHO细胞分泌表达一个膜蛋白,从上游构建开始,我该如何选择可以在CHO中进行高效表达的载体?如果使用pCDNA3.1,启动子,增强子我该如何处理?如何选择信号肽啊?刚开始接触,有太多不明白的地方了,请大家帮帮忙
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若然飞翔: 金币+2, 有帮助 2012-03-20 08:36:50
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2012-03-20 11:54:03
首先,完整的膜蛋白是不可能分泌表达的(你是指将膜蛋白表达在CHO细胞的细胞膜上吧?)。既然是膜蛋白,就用它自身的信号肽就好了。
表达时载体的确很重要,但也得分情况的:
如果你是想构建稳定的细胞株,那么你可以考虑用pcDNA3.1,也可以考虑用invitrogen的FlP-IN系统,更容易获得高表达细胞株;
如果是做瞬时表达,那么建议你用invitrogen的MembranePro™ Functional Protein Expression (FPE) System。
2楼2012-03-19 21:36:01
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普通回帖

若然飞翔

新虫 (初入文坛)

还想再请教一下,我的老板的意思是去掉自身的信号肽,连入一段分泌信号肽完成分泌表达,可行么?还有就是pcDNA3.1是不是既可以用于稳定表达又可以用于瞬时表达啊,我是只瞬时表达在胞外检测到就可以,并且实验室有这个载体,我可以用么?
3楼2012-03-20 08:41:10
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-19 21:36:01:
首先,完整的膜蛋白是不可能分泌表达的(你是指将膜蛋白表达在CHO细胞的细胞膜上吧?)。既然是膜蛋白,就用它自身的信号肽就好了。
表达时载体的确很重要,但也得分情况的:
如果你是想构建稳定的细胞株,那么你 ...

还想再请教一下,我的老板的意思是去掉自身的信号肽,连入一段分泌信号肽完成分泌表达,可行么?还有就是pcDNA3.1是不是既可以用于稳定表达又可以用于瞬时表达啊,我是只瞬时表达在胞外检测到就可以,并且实验室有这个载体,我可以用么?
4楼2012-03-21 08:01:57
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

帮帮忙吧
5楼2012-03-21 13:34:15
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

希望大家帮帮我
6楼2012-03-21 13:37:23
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

帮顶!
7楼2012-03-21 18:18:42
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若然飞翔: 金币+5, 有帮助 2012-03-22 21:27:48
我得理解:你只是想把该膜蛋白的胞外区分泌表达到培养基中,而不是表达完整的膜蛋白,对吗?
如果是这样,你可以用pCDNA3.1,没问题,只是表达量可能比较低。
比较经典的瞬时表达系统有两个,这两个瞬时表达系统都是有质粒的扩增系统,因而表达量比较高:
1)HEK293E +含有EBV ori 的质粒
2)HEK293 T or HEK293FT +含有SV40 ori的质粒
8楼2012-03-21 22:26:15
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十口心思

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若然飞翔: 金币+5, 有帮助 2012-03-22 21:26:52
分泌信号肽可以用优化的IL-2序列。可以参照一些商业化的质粒。真核分泌需要优化很多条件,顺转CHO没293高,可以达到每升几百毫克,但很麻烦。你没有经验,一般你最多只能做到ug/L的样子,可能搞了几升,最后拿到纯蛋白也就几微克。最后要做晶体? 那~
9楼2012-03-22 00:18:35
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 十口心思 at 2012-03-22 00:18:35:
分泌信号肽可以用优化的IL-2序列。可以参照一些商业化的质粒。真核分泌需要优化很多条件,顺转CHO没293高,可以达到每升几百毫克,但很麻烦。你没有经验,一般你最多只能做到ug/L的样子,可能搞了几升,最后拿到纯 ...

请问分泌信号肽是对所有蛋白都适用么?我需要根据目的蛋白进行选择么?我想用EPO的信号肽,因为EPO现在的工艺比较成熟,不知你有什么意见?
10楼2012-03-22 21:27:01
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