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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，提到了DNA，但是PCR扩不出来
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starseeker

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助，提到了DNA，但是PCR扩不出来

因为实验需要，使用的是大麦的种子而非叶片提取DNA，提完DNA后跑了下电泳，能看到很明显的条带。

但是做了几次退火温度和引物浓度梯度都扩不出来，只有引物二聚体，换了引物后还是这样......在看电泳图分析的时候我发现加了DNA模版与阴性对照相比，连引物二聚体都显得特别暗，现在初步怀疑是DNA模板的问题，请问各位在DNA提取和PCR的过程中，容易残留哪些东西会导致PCR抑制的？有没有相关的解决方法？
顺便贴一下我的DNA提取步骤，大家帮忙参考下，谢谢

1） 30 ~ 60 mg样品在液氮中研细后转入1.5 ml Eppendorf离心管中，加入500 μl TES；加50 ~ 100 μg Proteinase K混匀，置于55 ~ 60 ℃水浴30 ~ 60 min，期间轻轻混匀几次；
2） 用5 M的NaCl溶液调节盐浓度至1.4 M，加1/10体积的10 ％CTAB，置于65 ℃水浴10 min；
3） 加入等体积的酚，氯仿，异戊醇，0 ℃孵育30 min
4） 4 ℃，13000 g离心，取上清液至1.5 ml离心管中，加入等体积氯仿，异戊醇混匀，0 ℃孵育30 min以上，4 ℃，13000 g离心；
5） 取上清，加3 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，去除RNA；
6） 加0.6体积的预冷异丙醇，-20 ℃放置15 ~ 30 min；
7）  4 ℃，13000 g离心，弃异丙醇，70%乙醇洗2次。室温干燥，50 μl ddH2O溶解。

[ Last edited by starseeker on 2012-10-22 at 16:05 ]
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1楼 2012-10-22 15:49:51
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bluysky0902

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by starseeker at 2012-10-23 15:50:54
谢谢LS各位热心朋友的回复，问题解决了，的确是我的DNA模版的问题，纯化后扩出来了，各位的建议给了我很大的帮助，谢谢了

请问你是如何纯化的？我也遇到类似的问题，有的纯化了也不行，能否把步骤详细说说，谢谢~！
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17楼2012-10-30 10:31:32
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 15:51:14
引物可以设计长一些，提高退火温度试一试！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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相信自己，一定能成功！
2楼2012-10-22 16:07:58
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chui2004 at 2012-10-22 16:07:58
引物可以设计长一些，提高退火温度试一试！

引物分别是20和21bp，我换过引物，应该不是这个问题
退火温度我从50~65都试过，不行......
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3楼2012-10-22 16:18:58
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匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+5, ★有帮助 2012-10-22 17:33:01
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:53:47
本帖仅楼主可见
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4楼2012-10-22 17:13:14
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juzilesley

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-22 18:41:02
你的扩增体系能否让我们看看？还有，你用的什么试剂盒？换管酶试试？ *^o^*

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-10-22 17:18:45
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiaolichao at 2012-10-22 17:13:14
我感觉你DNA提取的还不错了，一般影响pcr扩增的是蛋白，多酚，多糖等；
还有你没有说清楚你用的什么引物，是自己设计的，还是文献上查到的？你确定你所选用的引物与目的基因匹配吗？


谢谢你的回复，这是我的引物，是根据大麦的醇溶蛋白B1用NCBI设计的，一开始我也怀疑是引物问题，所以换过引物，这是第二次设计的...都扩不出来，所以我怀疑是我的模版不好
现在我缺乏阳性对照，所以没办法很好的验证引物，我考虑使种子发芽后用幼苗提取DNA再试一次
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6楼2012-10-22 17:28:22
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by juzilesley at 2012-10-22 17:18:45
你的扩增体系能否让我们看看？还有，你用的什么试剂盒？换管酶试试？ *^o^*

谢谢你的回复，DNA我是手提的，酶是TAKARA的，因为我前面刚做的另一个玉米样品扩出条带了，所以觉得试剂应该没问题，不过的确也有可能
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7楼2012-10-22 17:31:26
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiaolichao at 2012-10-22 17:13:14
我感觉你DNA提取的还不错了，一般影响pcr扩增的是蛋白，多酚，多糖等；
还有你没有说清楚你用的什么引物，是自己设计的，还是文献上查到的？你确定你所选用的引物与目的基因匹配吗？

蛋白和多酚污染可以用氯仿：异戊醇除去对吗？那请问多糖有什么很好的办法去除呢？
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8楼2012-10-22 17:32:49
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yananhl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-22 18:40:52
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-30 15:53:57
换一次引物扩不出来不能就否定不是引物的问题，引物很重要。有时候换很多引物才扩出来的现象很多。我觉得你的DNA模板还可以，不错，应该满足你的实验吧，拖带也不多。
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9楼2012-10-22 17:59:47
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-22 17:59:47
换一次引物扩不出来不能就否定不是引物的问题，引物很重要。有时候换很多引物才扩出来的现象很多。我觉得你的DNA模板还可以，不错，应该满足你的实验吧，拖带也不多。

谢谢你的回复，可能是引物有问题，但是我无法确定，我还是想办法先去搞一个阳性对照试试吧
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10楼2012-10-22 18:36:56
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