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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，提到了DNA，但是PCR扩不出来
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lihongyou000

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:14:35
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:54:08
我觉得可能是你模板量的问题，目的基因拷贝太少。尝试把模板量加大一点，温度适当低一点，如果还不行，做巢式PCR,把第一轮产物做模版，进行第二轮PCR.
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11楼2012-10-22 18:43:04
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:13:21
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-30 15:54:18
如果你能确定你的引物没有问题的话，换掉你所有的PCR体系中的试剂，包括酶，我以前也遇到过这种问题，当我把所有试剂都换掉之后，问题解决了，这是最快的解决方式
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12楼2012-10-22 19:39:36
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:13:29
starseeker: 金币+4, ★有帮助 2012-10-23 15:52:00
starseeker: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2012-10-23 15:52:48
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-10-30 15:54:33
我认为引物应该不会有问题，都是用软件设计的。只要严格按照要求设计就行。
我觉得你的DNA里可能有些抑制扩增的东西。建议：1.得到DNA后，在用试剂盒纯化一次。2.做PCR时，把模板DNA做个几个稀释梯度，从1:10 000到1:100，再试试。
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13楼2012-10-22 20:02:30
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yangqq8282

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:14:00
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-30 15:54:44
1、确定你需要扩增的基因存在基因组中，而不是cDNA，NCBI上的基因序列要弄清来源。
2、你提取的DNA可以很好，不用担心DNA的问题，根据条带的亮度建议稀释一下再用。
3、如果基因序列信息没有问题，最有可能是引物问题。
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14楼2012-10-22 20:48:10
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chui2004

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:14:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by starseeker at 2012-10-22 16:18:58
引物分别是20和21bp，我换过引物，应该不是这个问题
退火温度我从50~65都试过，不行.........

我是觉得你的引物可以再长一点，可以25到30左右！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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相信自己，一定能成功！
15楼2012-10-22 23:27:18
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starseeker

铜虫 (初入文坛)
谢谢LS各位热心朋友的回复，问题解决了，的确是我的DNA模版的问题，纯化后扩出来了，各位的建议给了我很大的帮助，谢谢了
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16楼2012-10-23 15:50:54
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bluysky0902

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by starseeker at 2012-10-23 15:50:54
谢谢LS各位热心朋友的回复，问题解决了，的确是我的DNA模版的问题，纯化后扩出来了，各位的建议给了我很大的帮助，谢谢了

请问你是如何纯化的？我也遇到类似的问题，有的纯化了也不行，能否把步骤详细说说，谢谢~！
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17楼2012-10-30 10:31:32
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bluysky0902

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by starseeker at 2012-10-23 15:50:54
谢谢LS各位热心朋友的回复，问题解决了，的确是我的DNA模版的问题，纯化后扩出来了，各位的建议给了我很大的帮助，谢谢了

楼主，最近都不来了么？
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18楼2012-11-07 09:26:36
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