24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

starseeker

铜虫 (初入文坛)

应助: 3 (幼儿园)
金币: 47.3
帖子: 24
在线: 28.8小时
虫号: 1870935
注册: 2012-06-27
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 求助，提到了DNA，但是PCR扩不出来

因为实验需要，使用的是大麦的种子而非叶片提取DNA，提完DNA后跑了下电泳，能看到很明显的条带。

但是做了几次退火温度和引物浓度梯度都扩不出来，只有引物二聚体，换了引物后还是这样......在看电泳图分析的时候我发现加了DNA模版与阴性对照相比，连引物二聚体都显得特别暗，现在初步怀疑是DNA模板的问题，请问各位在DNA提取和PCR的过程中，容易残留哪些东西会导致PCR抑制的？有没有相关的解决方法？
顺便贴一下我的DNA提取步骤，大家帮忙参考下，谢谢

1） 30 ~ 60 mg样品在液氮中研细后转入1.5 ml Eppendorf离心管中，加入500 μl TES；加50 ~ 100 μg Proteinase K混匀，置于55 ~ 60 ℃水浴30 ~ 60 min，期间轻轻混匀几次；
2）用5 M的NaCl溶液调节盐浓度至1.4 M，加1/10体积的10 ％CTAB，置于65 ℃水浴10 min；
3）加入等体积的酚，氯仿，异戊醇，0 ℃孵育30 min
4） 4 ℃，13000 g离心，取上清液至1.5 ml离心管中，加入等体积氯仿，异戊醇混匀，0 ℃孵育30 min以上，4 ℃，13000 g离心；
5）取上清，加3 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，去除RNA；
6）加0.6体积的预冷异丙醇，-20 ℃放置15 ~ 30 min；
7） 4 ℃，13000 g离心，弃异丙醇，70%乙醇洗2次。室温干燥，50 μl ddH2O溶解。

[ Last edited by starseeker on 2012-10-22 at 16:05 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

1楼 2012-10-22 15:49:51

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

jimmy7633

木虫 (著名写手)

应助: 22 (小学生)
金币: 14322.1
红花: 1
帖子: 1153
在线: 104.3小时
虫号: 727882
注册: 2009-03-21
性别: GG
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
starseeker: 金币+1, ★有帮助 2012-10-23 10:13:29
starseeker: 金币+4, ★有帮助 2012-10-23 15:52:00
starseeker: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2012-10-23 15:52:48
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-10-30 15:54:33

我认为引物应该不会有问题，都是用软件设计的。只要严格按照要求设计就行。
我觉得你的DNA里可能有些抑制扩增的东西。建议：1.得到DNA后，在用试剂盒纯化一次。2.做PCR时，把模板DNA做个几个稀释梯度，从1:10 000到1:100，再试试。