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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于pET-32a表达的一些问题
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 关于pET-32a表达的一些问题

我的目的蛋白大概78Kd，使用pET-32a表达载体，酶切位点为sacI和Xhol，
上游引物 5G GAGCTC（SacI）ATGGTTGCAGCAGCAGAAAT3
下游引物 5CCG CTCGAG（Xhol）TCAGAATGGGCCAGGAGTTC3
设计的引物上游有起始密码子，下游有终止密码子，那么最终表达的蛋白到底有多大呢？求大神指点
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1楼 2012-10-09 15:10:07
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
……你都说你目的蛋白78kd了，那你表达出来的应该就是78kd+HIS标签的大小.
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weining1203
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-10-09 15:13:15
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-10-09 15:13:15
……你都说你目的蛋白78kd了，那你表达出来的应该就是78kd+HIS标签的大小.

哦。。。 不太明白，加几个HIS，请说详细点，本人小白，谢谢您
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3楼2012-10-09 15:42:44
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by weining1203 at 2012-10-09 15:42:44
哦。。。 不太明白，加几个HIS，请说详细点，本人小白，谢谢您...

加几个HIS取决于你用的载体.以6个His为例子，分子量是155*6=1KD
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weining1203
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-10-09 15:56:54
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-10-09 15:56:54
加几个HIS取决于你用的载体.以6个His为例子，分子量是155*6=1KD...

谢谢
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5楼2012-10-11 14:51:18
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ypan

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-12 15:45:59
weining1203: 金币+8, ★有帮助 2012-10-12 20:12:09
做SDS-PAGE大概的显示条带为90～100KDa.

在你的目的蛋白前面还有约170个氨基酸，包括Trx.TAG, S.TAG, His.TAG等蛋白序列。

核对pET-32a质粒图谱算出来。
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weining1203
6楼2012-10-11 16:12:56
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-12 15:46:09
楼上说得对，pET32载体上还有Trx.tag, S.tag, His.tag序列，根据pET系统的说明书，插入大小约为20.4 kDa，加上原来的78 kDa，大约100 kDa。
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weining1203
7楼2012-10-11 18:27:02
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by ypan at 2012-10-11 16:12:56
做SDS-PAGE大概的显示条带为90～100KDa.

在你的目的蛋白前面还有约170个氨基酸，包括Trx.TAG, S.TAG, His.TAG等蛋白序列。

核对pET-32a质粒图谱算出来。

谢谢
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8楼2012-10-11 19:41:05
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weining1203

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by hippo_li at 2012-10-11 18:27:02
楼上说得对，pET32载体上还有Trx.tag, S.tag, His.tag序列，根据pET系统的说明书，插入大小约为20.4 kDa，加上原来的78 kDa，大约100 kDa。

谢谢
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9楼2012-10-11 19:41:14
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thaw

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
32上游Trx tag和6his tag加一下把
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10楼2012-10-12 12:35:02
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