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celia2012铜虫 (小有名气)
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PCR反应体系 已有1人参与
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最近在做RTPCR，做对照的总是在30个循环做样出现CT值，总觉得是污染了，试了各种方法还是这样，怀疑有引物二聚体产生，请问反应体系中如果模板浓度叫高，是加大引物量还是减少， 之前做的反应体系为：SYBR MIX:10UL 引物：0.8ul 水：7.4微升 做338f-518r引物CT值大概在12,13左，模板浓度较高，如何优化体系 |
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mao19881205
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5楼2012-09-25 15:49:17
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【答案】应助回帖
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celia2012: 金币+4 2012-09-25 13:07:11
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celia2012: 金币+4 2012-09-25 13:07:11
| 你的问题不是很清楚。如果你觉得你用做反转录的RNA有DNA污染，需要优化DNase消化的条件。反转录时做负对照，用于检测RNA样品中的痕量DNA污染。至于你说的模板浓度较高，你可以根据情况稀释。我一般是用1ug RNA做反转录，稀释5倍后取1ul做PCR。这只是一般而言，丰度很高或者很低的mRNA要根据情况稀释。还有你给出了引物的体积，不知道你用的引物浓度多少。一般RTPCR采用终浓度为0.2-0.5uM。如果你认为有引物二聚体产生，可以适当降低引物浓度。 |
3楼2012-09-25 07:17:52
mamadexiao
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4楼2012-09-25 15:47:36