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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » PCR-DGGE的土壤保存问题
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者2011210200将赠送您 1 个金币

2011210200

金虫 (小有名气)

[求助] PCR-DGGE的土壤保存问题

土样采了一个月了，一直放在4度里做稀释平板和BIOLOG，现在做完了打算做DGGE，于是整理了土样，放入-20度。在4度保存了一个月会不会有什么影响？提DNA能提出来吗？
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1楼2012-09-23 16:58:20
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remax520

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2011210200: 金币+2, ★有帮助 2012-09-29 11:14:51
提取DNA是可以提取出来的 但是可能条带亮度上会有不同,至于能不能达到DGGE的要求,就不好说了,4度保存多少会有些影响的.
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2楼2012-09-23 22:03:46
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2011210200

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by remax520 at 2012-09-23 22:03:46
提取DNA是可以提取出来的 但是可能条带亮度上会有不同,至于能不能达到DGGE的要求,就不好说了,4度保存多少会有些影响的.

谢谢你，那如果条带不够亮的话，有没有什么解决办法？比如富集、浓缩等，或是再进行一次扩增？
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3楼2012-09-23 22:40:11
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remax520

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 2011210200 at 2012-09-23 22:40:11
谢谢你，那如果条带不够亮的话，有没有什么解决办法？比如富集、浓缩等，或是再进行一次扩增？...

可以一次多提取几个样品富集一下。一般用新鲜的样品最好了。
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4楼2012-09-24 10:45:44
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yexinlaura

金虫 (正式写手)
学习一下
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5楼2012-09-24 11:00:50
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kiruwa

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
2011210200: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-09-29 11:14:29
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-03 17:27:47
4度保存理论上对微生物群落会产生一些影响。 不过DGGE本身就是灵敏度很低的技术，实际上影响不大。 DNA提不提的出来和原土样的微生物biomass成分有很大关系，很放在4度多久没太大关系。
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请注意,照片不是我本人!!!请不要把此人和我的长相联系到一起去.
6楼2012-09-24 11:15:33
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kiruwa

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
2011210200: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-09-29 11:14:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by 2011210200 at 2012-09-23 22:40:11
谢谢你，那如果条带不够亮的话，有没有什么解决办法？比如富集、浓缩等，或是再进行一次扩增？...

用试剂盒提取土样DNA的时候，最后一步用20ul 水溶（说明书建议用100ul水溶），可以增加DNA浓度。另外可以浓缩DNA。 不建议二次扩增。 PCR本来就是biased的技术，二次扩增会amplify这种bias。
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7楼2012-09-24 11:17:46
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佳佳cathy

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
8楼2012-11-03 09:41:07
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-03 17:27:54
4度肯定会有影响，首先个别种类细菌会生长，本来量少的低温菌可能就会生长，而大量细菌生长缓慢或是停滞，造成菌群差异，提出来的DNA里面各种菌的浓度可能相比于原始土样有所差别，对之后DGGE条带亮度影响较大，无法正确区分优势菌群。第二，可能会有一些细菌干脆就死掉了，不过一个月DNA降解应该影响不是很大。总之，现在进行DGGE已经不大好了，也很难有解决办法，毕竟你无法使土壤恢复到原始土壤的菌群结构。我们用来做DGGE的土壤都是直接保存在-80度的。
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9楼2012-11-03 14:40:58
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梦幻心雨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kiruwa at 2012-09-24 11:15:33
4度保存理论上对微生物群落会产生一些影响。 不过DGGE本身就是灵敏度很低的技术，实际上影响不大。 DNA提不提的出来和原土样的微生物biomass成分有很大关系，很放在4度多久没太大关系。

你好，请问一下，-20℃储存的土壤，进行细菌培养计数（用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基），用不用提前拿出放室温，以恢复微生物活性呢？
有的文献说在23-25℃放置7天，以恢复微生物活性。
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科研工作于我若即若离。。。
10楼2016-11-01 16:04:52
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