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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我构建质粒后酶切验证的问题
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rainbow8

新虫 (小有名气)

[交流] 我构建质粒后酶切验证的问题

大家好，我构建一个质粒载体处理过后待连接的长度是4.9kb，片段待连接的长度是3.5k 连接后我用片段上的两个单酶切位点双酶切，正常验证结果是6.7k和1.7k两个片段 可是我1.7k的条带对了 6.7k的条带与marker比像是只有5k多，不知道这是怎么回事，如果没连接上应该双酶切没有条带的，既然连接上了怎么大片段像是少了1kb
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1楼 2012-09-21 13:17:22
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tupac225

金虫 (正式写手)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
你拿去测序不就行了，有时候可能是跑胶的问题。
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2楼2012-09-21 13:27:59
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gelois

金虫 (正式写手)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
最好送去测序，有的时候跑胶并不能准确的判断其大小，只是估算一下。而且一般MARKER也没那么准确。
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3楼2012-09-21 13:33:54
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
你用其他酶切一下，看看是不是质粒大小就有问题。
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4楼2012-09-21 14:51:34
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
5楼2012-09-23 14:16:55
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乱舞成影

金虫 (小有名气)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
重新提质粒，一部分做个PCR 另一部分再次用你的那两个酶双酶切。
如果你的跑胶图只有你那1.7和5k的两条带。那就不是酶切位点的问题，可能是你构建的质粒本身的问题了。供参考！
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6楼2012-09-23 14:31:22
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小神龙198901

金虫 (正式写手)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
对…跑胶是有可能出问题的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2012-09-23 15:02:21
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doudou588588

铁虫 (初入文坛)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
与结构有关  大片段的电泳不是精确    酶切验证准确

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2012-09-23 16:12:50
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
楼主载体里面不会有酶切位点吧
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9楼2012-09-23 21:45:26
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junminh

铜虫 (小有名气)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
1）单酶切看下总长对不对；2）测序；
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10楼2012-09-24 10:57:26
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houchm0927

金虫 (小有名气)
★
rainbow8(金币+1): 谢谢参与
前几天构建载体有类似情况。PCR检测正常，提质粒双酶切也可以切下正确大小的片段，只是载体大小减半了，送去测序也测不出来！我就重新做了，后来就好了。我觉得直接重做得了，有时候这种偶然意外真的很难找原因，当然楼主送去测序看看也好，祝好运。
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11楼2012-09-24 19:39:45
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Marado

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1：楼主干嘛不用你连接表达载体时候设计的两个酶切位点切，这样直接切出目的条带跟载体，还能验证目的片段中是不是有设计了的酶切位点.
2：一条比Marker少了1000多，可能的原因是电泳问题，总感觉超过5000后，Marker都只能是参考，估算一下而已
3：有多出的酶切位点，把你那一条再一次酶切出1000多的片段
PS：送测序吧……
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12楼2012-09-25 08:59:44
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Happy实验室

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是没有连接完全，建议你最好在目的基因和载体上都选择一个位点，这样可靠一些
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13楼2012-10-02 23:29:31
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wangqi20092

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
查一下片段内部有没有你用的酶切位点，另外测序。
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14楼2012-10-04 12:03:33
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