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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

[求助] PCR条件摸索

各位大侠。。。帮我看一下吧，从左到右分别是56度，58度，60度，61、62、63度，然后使阴性，MARKER。。。我的目的基因长度是1436bp。模板我用GADPH验证过的，所以这次Ｐ的时候就没有Ｐ内参。我想说的是既然我的阴性对照没有东西，说明我的引物没有引物二聚体，现在我想是不是应该改变一下PCR条件呢？帮忙分析一下吧。。。3Q so much。。。我想知道原因是什么呢？
我的PCR条件是94度 5min，94度40s，55-65度30s，72度3min，72度10min 总共35个循环。。。

zlf(9-13).jpg
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keepon
1楼 2012-09-13 15:31:47
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你的图看，貌似是你的退火温度有点高了，问什么不调低一点试一下呢？
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-13 16:39:56
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
阁下为什么说温度有点高了呢？我觉得特异性不好的话应该是温度低了呢。。。我还想把温度调高试一下呢。。嘿嘿。。。不懂。。。还请赐教。。。
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keepon
3楼2012-09-13 18:03:13
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物特异性差，而且根据梯度PCR看，高温引物特异性没有增加，反而影响了引物与模板的结合，造成产物减少，最好还是重新设计下引物，另外1.5KB 延伸3分钟太长了吧
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4楼2012-09-13 18:40:54
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 18:40:54
引物特异性差，而且根据梯度PCR看，高温引物特异性没有增加，反而影响了引物与模板的结合，造成产物减少，最好还是重新设计下引物，另外1.5KB 延伸3分钟太长了吧

写错了 延伸2min。我这个引物有两篇文献是报道过的 用的就是这个引物来P的 所以我想应该没什么问题噻。。。
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keepon
5楼2012-09-13 22:18:19
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-09-13 22:18:19
写错了 延伸2min。我这个引物有两篇文献是报道过的 用的就是这个引物来P的 所以我想应该没什么问题噻。。。...

如果说引物没有问题的话，会不会你的模板出现问题了，不知道你的模板怎么来的，会不会纯度不够，参杂着其他东西，另外你的PCR产物和Marker是点的同样的量吗，35个cycle你的PCR产物量太低了，一是有非特异性扩增，而是你的模板量少
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6楼2012-09-13 23:09:29
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 23:09:29
如果说引物没有问题的话，会不会你的模板出现问题了，不知道你的模板怎么来的，会不会纯度不够，参杂着其他东西，另外你的PCR产物和Marker是点的同样的量吗，35个cycle你的PCR产物量太低了，一是有非特异性扩增，而 ...

PCR产物和Marker是点的同样的量啊。。。这个有关系吗？一般我们都是35个循环啊。。。我只是想想知道怎样提高我的目的基因的条带？
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keepon
7楼2012-09-14 08:41:25
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wu_shiyong

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
照LZ说的 基本上都没有问题
看图显然后面的退火温度较高，55度可以试一下，而且可以换下好点的酶试试！
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低调稳重务实内敛---------------残
8楼2012-09-14 08:56:33
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wu_shiyong at 2012-09-14 08:56:33
照LZ说的 基本上都没有问题
看图显然后面的退火温度较高，55度可以试一下，而且可以换下好点的酶试试！

恩 今天我正在降低温度P一下。。不行也准备换个酶。。。哎。。。纠结死了。。。
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keepon
9楼2012-09-14 11:10:57
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-14 16:28:03
1、marker条带也不清楚，这证明你的胶也做的不是太好。
2、再降低退火温度。首先不要管特异性的问题，你至少要能找到可以扩出目的片段的退火温度，然后在那个温度附近再调整退火温度，以解决特异性的问题。不过这些的前提是你的电泳结果要清晰。
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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
10楼2012-09-14 11:46:39
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